一株高产木聚糖酶真菌的筛选及酶学性质分析

孙 婕，郁惠蕾，李春秀，寇振福，许建和

(华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237)

从生物质中提炼可持续利用的生物能源，已经渐渐成为各国应对能源危机的主要策略之一。生物质大量存在于自然界中，主要从农作物残余物的木质纤维素中获得，由于其来源广泛且成分复杂，因此，完全降解木质纤维素存在一定的难度。

木质纤维素的主要组分包括纤维素、半纤维素及木质素等三大类。纤维素是一种以β－1，4－糖苷键聚合而成的葡萄糖聚合物，而半纤维素则是位居第二的组分，与纤维素之间以非化学键结合，所占比例范围为15% ～35%［1］，高效降解半纤维素便可以暴露更多的纤维素酶作用位点，提高木质纤维素的降解效果。半纤维素的完全降解则需要多种酶类的协同作用，主要包括主链的β－1，4－木糖苷键裂解酶和侧链的取代基团裂解酶(如阿拉伯糖呋喃糖苷酶等)，其中主链酶包括木聚糖内切酶(endo－1，4 －β －xylanase，EC 3.2.1.8)和木糖苷酶(β －D－xylosidase，EC 3.2.1.37)。自然界存在的半纤维素酶往往以多酶复合物形式存在，主要来源于细菌、真菌、放线菌等［2］。已报道的酶活较高的菌株主要集中在木霉属(Trichoderma sp.)和曲霉属(Aspergillus sp.)中。本研究主要是利用一种快速筛选的手段从自然界中筛选高产半纤维素酶的新菌株，并对其产酶性能进行初步研究。

传统的菌株筛选工作需要耗费大量的时间和精力，具有周期长、重复性差等缺点，因此建立一种高通量筛选方法是加快筛选进程的关键因素。纤维素酶高通量筛选的方法已被多个课题组报道［3－5］，而将此平台应用于半纤维素酶中尚未见报道。在初步分离的候选菌株复筛过程中，笔者利用96孔板系统进行菌株培养、酶液分离以及酶活测定的快速筛选过程，同时考察天然半纤维素底物的处理以及浓度对产木聚糖酶的影响和效果，以期为今后进一步的应用研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 土样采集与底物处理

所用土样采自全国各地，使用距离地面至少10 cm的土样，以环境多样性为标准。收集到的土样用无菌水梯度稀释后，进行平板筛选和液体筛选。

筛选底物玉米芯粉、稻草以及小麦秆先被粉碎成颗粒，经过0.15 mm分样筛得到所需大小的粉末，再分别将10 g粉末置于500 mL三角瓶中，加入4%NaOH 300 mL，121℃加热蒸煮20 min，冷却后用纱布过滤除去固体，滤液4℃保存过夜，5 mol/L HCl中和至中性，4℃静置过夜;发现会有沉淀生成，8000 r/min离心15 min，去上清，沉淀再用95%乙醇洗涤3次，最后的泥状沉淀经干燥碾磨后，作为微生物筛选的半纤维素底物。

1.2 菌株初筛

初筛培养基(g/L):半纤维素粉10.0，酵母膏4.5，NH4NO33.0，NaCl 5.0，K2HPO42.0，MgSO4·7H2O 0.2，琼脂 15.0;pH 7.0(液体培养基成分相同，不加琼脂)。将土样稀释后涂布到初筛培养基平板，培养2～3 d后，挑取单菌落进行液体纯培养，再接种到新的培养平板上，测定半纤维素酶活性透明圈的大小［6］。

1.3 菌株复筛

将泥状半纤维素沉淀均匀平铺在培养皿上(3～5 mm厚度)，静置1～2 h，65℃干燥过夜。得到的均一底物薄片，用打孔器切成圆片状，作为96孔深孔板酶发酵的底物。每个孔中加入1 mL初筛培养基(不含玉米芯粉)和1片上述预制的底物薄片，置于30℃、500 r/min的振荡器(HTC Biotech Co.)上培养 2 d，4000 r/min 离心 5 min，测定上清液酶活，测定体系为(96孔深孔板)100 μL木聚糖溶液(1 mg/mL birchwood xylan，Sigma公司)、180 μL 50 mmol/L pH 5.0 醋酸钠缓冲液、20 μL 酶液。50℃水浴保温1 h后，加入120 μL 3，5－二硝基水杨酸(DNS)，煮沸5 min，待冷却后加入160 μL去离子水，混匀后移取200 μL到酶标板，用酶标仪测定550 nm下吸光值。

1.4 木聚糖酶活力的测定

在试管中分别加入1 mL木聚糖溶液(1 mg/mL)和1.8 mL pH 5.0醋酸钠缓冲液，再加入0.2 mL稀释5倍的粗酶液，50℃反应15 min，加入2 mL DNS，煮沸10 min，定容至10 mL。用分光光度计测定550 nm波长的吸光度(OD550)，测定时以缓冲液作为空白对照。定义每分钟催化产生1 μmol木糖的酶量为1个活力单位(U)。

1.5 发酵产酶条件优化

发酵培养基(g/L):玉米芯粉10.0，KH2PO43.0，蛋白胨 1.0，K2HPO42.0，MgSO4·7H2O 0.5，NaNO32.0，CaCl2·2H2O 0.1，Mandels 1%(V/V，pH 5.0)。其中 Mandels溶液成分为 MnSO40.16%，ZnSO40.14% ，FeSO40.5% ，CoCl20.2%［7］。发酵优化在装有50 mL培养基的250 mL锥形瓶中进行，分别调节培养时间、pH、C源种类和C源浓度进行考察。培养结束后将培养液在10000 r/min离心20 min，取上清液测定胞外酶的活力。

1.6 菌种鉴定

在1.5 mL离心管中加入100 μL无菌水，刮取3～4环新鲜培养的菌丝体于离心管中。振荡均匀后，8000 r/min离心2 min，弃上清液。在1.5 mL离心管中加入150 μL裂解液(江南大学中国高校工业微生物资源与信息中心提供)，振荡均匀后，85℃反应25 min得到基因组DNA粗提液。利用ITS序列通用引物(上游:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3';下游:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')进行PCR扩增、纯化及测序。最后将测序结果进行BLAST比对。

1.7 酶的纯化及初步表征

收集发酵上清液，冰浴中进行(NH4)2SO4分级沉淀，每加入20%饱和度的细磨(NH4)2SO4粉末后，静置0.5 h，8000 r/min离心10 min。沉淀的各个分级蛋白用50 mmol/L、pH 6.0醋酸铵缓冲液溶解，透析过夜，并测定木聚糖酶活力。选用40% ～60%蛋白组分进行超滤，4℃、8000 r/min离心30 min，取浓缩后的酶液4℃、10000 r/min离心10 min，取上清液500 μL进行Superdex G－75凝胶过滤。采用AKTA Explorer层析系统，50 mmol/L pH 6.0醋酸铵缓冲液洗脱，流速为0.5 mL/min，自动收集每管500 μL组分，分别测定酶活，SDS－PAGE法测定相对分子质量。考察pH对酶活力的影响:将酶液置换到不同pH缓冲液(pH 3.0～6.0柠檬酸盐缓冲液，pH 5.5～8.0磷酸盐缓冲液，pH 8.0～10.0巴比妥钠盐酸缓冲液)中，室温放置5 h，冰浴0.5 h，测定残余木聚糖酶活力。考察反应温度对酶活力的影响:分别在不同温度下，测定木聚糖酶活力来确定最适温度。

2 结果与讨论

2.1 菌株筛选及鉴定

2.1.1 菌株初级筛选结果

从自然界中筛选木聚糖酶已有报道［8－10］。笔者采用3种不同的农作物秸秆作为筛选底物，同时对底物进行预处理，去除纤维素等其他成分，得到其中的半纤维素成分，以筛选能产半纤维素酶的菌株。上百份采集到的土样，经固体培养基分离、液体纯培养后，测定活性透明圈大小，结果见图1。

根据底物和土样的不同，共有11个批次，D值表示透明圈的直径，d值表示菌落直径，D/d较大表示菌株的产酶能力较强。由图1可知:共有564个单菌落表现出了半纤维素降解酶活性，其中362株菌株的透明圈D/d在0～5之间，123株菌株的透明圈D/d在5～8之间，透明圈D/d大于8的共有79株。值得注意的是，大多数带有菌丝的菌株的D/d都大于8。同时发现以水溶性较好的小麦秆作为底物时，较容易筛选得到较高酶活的菌株。进一步对筛选得到的D/d大于5的202株菌株进行了木聚糖酶活力的复筛。

图1 利用透明圈法初筛产酶菌株的数据统计Fig.1 Primary screening of microbial strains through halo-forming method

2.1.2 菌株复筛结果

对202株菌株的木聚糖酶活力进行了复筛，建立了一个基于96孔深孔板的菌株培养、酶液分离以及酶活测定的平台，并考察了该方法的操作可行性与数据可靠性。首先，半纤维素泥状沉淀被加工成均一圆片状，避免了大量不可溶底物的繁琐称量过程。其次，将部分菌株的初筛D/d与孔板测得的木聚糖酶活力比较，发现两者趋势基本一致(图2(a))。将排名前13的菌株酶活与购买的4株保藏菌株(上海工业微生物所)进行了比较(图2(b))。购买的菌株分别为黄孢平革原毛菌(Phanerochaete chrysosporium)、黑曲霉(Aspergillus niger)、绿色木霉(Trichoderma viride)和里氏木霉(Trichoderma reesei)，发现其中黑曲霉的木聚糖酶活力在购买的菌株中是最高的。而筛选得到的 PAM111、UV4、PDA23、H29、RS14、RS88、RS91、RS97、WS40、WS191、M1、ECU2023、WDF8 的酶活都相对较高，其中ECU2023的酶活最高，约是A.niger酶活力的1.3倍，菌株H29、M1和RS88也都显示出了较高的木聚糖酶活力。具有较高活力的菌株均产生明显的菌丝体或孢子。

2.1.3 菌株鉴定结果

对筛选到的ECU2023菌株进行鉴定，利用丝状真菌(及酵母)的核糖体rDNA内部转录间隔区(internaltranscribed spacer，ITS)的 方 法，对ECU2023序列进行BLAST比对，鉴定为泡盛曲霉(Aspergillus awamori)。

2.2 ECU2023菌株发酵条件的优化

2.2.1 培养时间的影响

图2 复筛菌株的木聚糖酶活力比较Fig.2 Xylanase activity assay in second-round screening of strains

图3为发酵培养时间对木聚糖酶活力的影响。由图3可知:培养至第4天时木聚糖酶活力达到最高，酶活从大到小依次为 A.awamori ECU2023、RS88、A.niger、M1、H29，这与 96 孔板筛选的酶活结果是一致的。接种24 h后，观察到有少量菌丝或孢子形成，但是木聚糖酶活力较低。培养时间超过48 h后，有大量菌丝或孢子产生，而且木聚糖酶活力迅速增加，在第4天时达到最高值。菌体培养时间超过4 d后，酶的活力都有所降低。

图3 培养时间对木聚糖酶活力的影响Fig.3 Effects of culture time on xylanase activity

2.2.2 pH 的影响

通过初筛、复筛以最后确定酶活最高的ECU2023为选定菌株，对其培养基pH进行考察，发现ECU2023的pH适应范围较广，在pH 4.0～9.0范围内酶活差异不超过7%，在pH 6.0时酶活达到最高。这与文献［11］报道的木聚糖酶活力最佳pH相符合。

2.2.3 C 源的影响

共考察了13种C源(20 g/L)，包括一些单糖(葡萄糖、木糖等)、模式底物(微晶纤维素(αcellulose)、羧甲基纤维素钠(CMC)等)和天然底物(玉米芯、稻草、小麦秆粉等)，产酶结果如图4所示。从图4可以看出:当以天然底物为C源时，木聚糖酶活力要明显高于其他底物，其中以玉米芯粉和小麦秆粉的效果最好，酶活分别可达到36.7和28.9 U/mL。主要原因可能是天然底物虽然没有经过预处理，但是富含木聚糖，可以诱导产生木聚糖酶，与之前报道的麸皮、稻草和甘蔗等的诱导效果相对应［12－15］。进一步采用玉米芯粉和小麦秆粉作为底物，考察C源浓度对产木聚糖酶的影响。

图4 培养基C源优化结果Fig.4 Optimization of carbon sources in fermentation culture

2.2.4 C源质量浓度的影响

C源浓度的考察结果见图5。由图5可知:ECU2023利用不同基质时，其底物耐受度也有差别，但都有一个最适浓度，玉米芯粉为40 g/L，小麦秆粉为50 g/L。天然底物浓度过低或过高都会影响分泌木聚糖酶，以小麦秆粉作为底物时，低于40 g/L或者高于50 g/L都会大大降低木聚糖酶活力。而以玉米芯粉作为底物时，在10～70 g/L都能稳定地分泌出木聚糖酶。底物浓度过低时不利于诱导菌体产酶，浓度过高时会形成较厚的悬浮层，而不能充分混匀从而影响传质。发酵过程中，发现在培养初期底物的固体颗粒沉在摇瓶底部，当培养一段时间后，菌体已经将固体颗粒包裹或消化，发酵液底部无颗粒沉淀，混浊消失，菌体呈现球状，这可能跟霉菌利用半纤维素的方式有关。从经济效益考虑，以天然物质为底物，也可大大降低成本，采用30～40 g/L的玉米芯粉最为合适。

图5 培养基C源的质量浓度优化Fig.5 Optimization of carbon source concentration in fermentation of xylanase

2.3 木聚糖酶的纯化及酶学性质的初步表征

经40% ～60%(NH4)2SO4分级沉淀后，上样至Superdex G－75进行凝胶过滤，图6(a)为层析洗脱曲线，酶活峰出现在20管左右，比酶活达到 36.6 U/mg，纯化倍数为 27.7 倍，收率为0.93%，操作过程中损失较多。SDS－PAGE结果见图6(b)，发现较明显蛋白条带的相对分子质量为 2.2 × 104。

图6 木聚糖酶Superdex G-75凝胶过滤洗脱曲线和SDS-PAGE电泳图Fig.6 Gel filtration on Superdex G-75 column of xylanase xylanase activity and SDS-PAGE of purified xylanase

粗纯化后的木聚糖酶最适pH和最适温度分别为6.0和50℃(图7)，同时，pH为5.0～8.0，温度为30～50℃，木聚糖酶活力都相对稳定。

图7 pH和温度对木聚糖酶活力的影响Fig.7 Effects of pH and temperature on xylanase activity

3 结论

初步筛选到能产透明圈的564株微生物菌株，利用基于96孔深孔板的筛选方法对其中202株菌株进行了快速复筛，共得到13株高产木聚糖酶的菌株，其中以编号ECU2023的酶活最高，鉴定为泡盛曲霉。对其培养条件进行了优化，确定培养条件:pH为6.0，培养时间为4 d，最佳C源为玉米芯粉，C源浓度为30～40 g/L。

对初筛菌株透明圈活性与96孔深孔板测得的木聚糖酶活力进行比较，发现酶活力的变化趋势是基本一致的，较高酶活的菌株用两种方法测定的活力都是相对较高的，可以认为这个快速筛选平台是可信的。同时，DNS法测还原糖往往需要多个步骤，对于大量试样的处理会耗费很多时间，利用96孔深孔板可大大提高该方法的效率。将来也可将此平台应用于筛选其他酶类。在考察C源时，发现C源的选择以及C源的浓度都会影响木聚糖酶的分泌。而大多数木聚糖酶都被分泌到胞外。因此，采用了天然农作物秸秆作为底物，其中玉米芯粉富含半纤维素，发现使用玉米芯粉时酶的活力比用单糖作C源时增加很多。基质浓度越低或越高并非有相同的效果，底物浓度越高可能会产生大量有毒性的中间产物，阻遏酶的合成，然而，底物浓度过低又不足以诱导木聚糖酶的产生。

初步纯化得到的木聚糖酶活力在pH 5.0～8.0范围内都相对稳定，具有潜在的商业应用价值，相信通过进一步的分子改造，可用于造纸、食品、能源等工业。利用本文报道的筛选平台发掘更多新的木聚糖酶，有利于促进木聚糖酶的产业化应用，尤其是可以通过提高与纤维素酶的协同作用来解决非常迫切的能源与环境等可持续发展问题。

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