环氧水解酶的结构基础及新酶开发

孔旭东，郁惠蕾，周佳海，许建和

(1.华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237;2.中国科学院 上海有机化学研究所 生命有机化学国家重点实验室，上海 200036)

目前，临床上所用的药物很大一部分具有手性。由于酶和细胞表面受体都具有手性，外消旋药物进入人体后，2种对映体在人体内的药理活性、代谢过程及毒性往往存在显著的差异。手性环氧化物及其开环产物邻位二醇由于可以与多种亲核试剂如醇、胺、羟胺、肼、卤素、腈等反应，从而成为有机合成中一类非常重要的手性合成砌块，在医药、农药、香料和精细化学品工业等方面都有着重要的应用价值。如利用手性缩水甘油衍生物与胺的反应可合成一大类重要的心血管药物β－肾上腺素阻断剂，包括普萘洛尔、阿替洛尔、比索洛尔等几十个品种［1－2］。此外，手性环氧前体可用于合成抗肥胖药物(L－肉碱)、抗艾滋病药物(茚地那韦)、钙通道阻滞药(地尔硫卓)、昆虫信息素(Frontalin)等等［3］。

手性环氧化物与其开环产物邻位二醇可通过多种生物转化方法合成，包括单加氧酶或过氧化物酶催化的烯烃不对称环氧化、脱卤酶催化的环氧拆分、环氧水解酶(epoxide hydrolases，简称 EHs，EC 3.3.2.3)催化外消旋环氧化物的水解拆分或对映归一性水解。EHs广泛存在于哺乳动物、植物、昆虫和微生物等几乎所有生物体内。最初在20世纪70年代发现环氧水解酶是由于其在哺乳动物体内对毒性环氧类物质的代谢功能［4］。其在生物体内的主要生理功能包括:在哺乳动物体内降解毒性环氧化物的解毒功能、在植物和昆虫中参与含环氧类信号分子的代谢与调控以及参与微生物环氧类碳源的代谢等［5］。20世纪90年代后对微生物来源EHs的广泛研究解决了EHs来源的问题，使它在手性环氧化物生物合成中的应用成为研究热点。作为生物催化剂，EHs具有反应时不需要金属离子和辅酶、酶的来源广泛、对映选择性高等优点，已被广泛应用于手性环氧化物及邻位二醇的合成。笔者主要从EHs的结构与功能、新型EHs的筛选及改造等方面综述了EHs在生物催化领域的研究进展。

1 EHs结构与功能

1.1 α/β 水解酶折叠EHs

第一个EHs的三维结构(ArEH，PDBID:1EHY)于1999由Nardini等［6］发现，它来源于放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter AD1)，与哺乳动物来源的sEH具有同源性。ArEH属α/β水解酶家族，其催化结构由α/β水解酶折叠结构域和1个盖子结构域组成(图 1a)，来自于 α/β 结构域的 Asp107、His275与Asp246所组成的催化三联体位于这2个结构域之间，目前所发现的大部分EHs均属于这一家族。该晶体结构的报道首次确定了位于盖子结构域中的2个酪氨酸Tyr152/Tyr215在催化过程中与底物结合和辅助环氧开环作用。几乎与之同时，Argiriadi等［7］报道了来源于鼠(Mus musculus)的MssEH(PDBID:1CQZ)晶体结构，它的C端具有与ArEH类似的α/β结构域与盖子结构域，虽然盖子结构域中α－helix的构象存在一定差别，但其中的2个Tyr的位置非常一致，进一步证明了它们参与了催化反应。该结构中活性位点位于1个L形通道中，与它所催化的长链脂肪酸环氧化物非常吻合。在它的N端还包含1个不具有催化功能的结构域，对MssEH二聚体的形成起重要作用。第3个α/β水解酶类的EH结构是来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的 AnEH［8］，虽然它与哺乳动物微粒体EHs(mEH)同源性更高，但缺乏膜锚定结构域，因此是一种可溶性的EHs。AnEH中类似于mEH的典型N－末端延伸区域，从α/β水解酶结构域的底部开始形成几个连续的α－helix环绕到盖子结构域的顶部，从而保持盖子结构域与α/β水解酶结构域更紧密的贴合。从2004年至今陆续又有3个α/β水解酶类EH晶体结构被报道，分别是来源于人(Homo sapiens)的 HssEH(PDB ID:1S8O)、来源于土豆(Solanum tuberosum)的StEH(PDB ID:2CJP)和来源于结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的 MtEHA(PDB ID:2BNG)。其中HssEH与mssEH非常相似，由N端的退化磷酸酶结构域和C端的环氧水解酶结构域组成。

自20世纪70年代EHs被发现后，EHs的催化机理就受到了广泛深入的研究［9］。到 1993年Lacourciere等［10］测定了在O环境下微粒体EHs单次转化后产物中放射性积累，他们同时结合了当时最新发表的脱卤酶晶体结构和催化机制以及其与mEH在序列上的相似性，提出的现在所普遍接受的催化机理(图1(d))。其中Asp在催化反应的第一步中作为亲核试剂进攻环氧碳原子，与底物形成酯中间体，其余2个残基His与Asp通过夺取水分子中的质子，产生OH－亲核进攻酯中间体发生水解，释放邻位二醇完成催化反应的第二步。水解过程中酯中间体的羰基氧所形成的氧负离子与空间上邻近的2个主链氨基组成的氧洞，从而形成稳态结构。到1999年ArEH晶体结构的报道进一步确认了这一机理，同时发现催化反应还涉及2个来自帽子结构域的Tyr，通过与环氧氧原子形成氢键增加其电负性，起着固定底物结合位置和辅助环氧开环的作用。

1.2 白三烯A4水解酶

第一个非α/β水解酶类EHs的晶体结构(来源于人的LTA4水解酶)于2001年由Thunnissen等［11］解析得到，是目前报道的唯一一个将环氧水解后产生非邻位二醇的EH。其结构属于α－α超螺旋折叠，由N端结构域、催化结构域和C端结构域三部分组成(图1b)。催化结构域具有嗜热蛋白酶结构特征，包含一个Zn2+结合位点，同时具有白三烯A4水解酶和氨基肽酶活性。结合模拟与定点突变实验结果可以确定其催化机理(图1e)，反应发生时配位结合于His295、His299与Glu318的Zn2+作为Lwies酸介导环氧开环，产生的C6碳正离子由白三烯中的共轭三烯传递至C12，随后从Asp375活化的水分子中夺取羟基完成水解反应。

图1 EHs催化机制Fig.1 Catalytic mechanism of epoxide hydrolases

1.3 柠檬烯1，2－EHs

2003年，Arand等［12］解析了来源于红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)的柠檬烯 1，2－EHs(limonene-1，2-epoxide hydrolase，LEH)的 3D 结构(PDB ID:1HS6)，它属于一类新的EHs，大小仅149个氨基酸。属于这一类EHs的晶体结构还包括结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的MtEHA(PDB ID:2BNG)和在链霉菌(Streptomyces lasaliensis)中参与聚醚合成的lsd19(PDB ID:3RGA)。它们的结构特征是具有1个由4个α－螺旋和6个高度弯曲的β－折叠所组成α/β桶状结构，桶的内侧形成1个深入蛋白内部的底物结合口袋，其催化残基包括位于底部的两个Asp与位于两者之间的Arg，口袋其余部分主要由疏水性残基所组成(图1c)。与第一类EHs相比，LEH催化机制仅包含一步反应(图1f)。在Tyr53与 Asn55的辅助下，由Asp132夺取水中的1个质子，产生的OH亲核进攻环氧，与此同时Asp101将质子传递给环氧氧原子。反应结束后Asp132再将质子通过Arg99传回Asp101，使酶回到初始状态。由于LEH通过单步反应完成水解，不涉及底物与酶的中间体状态，因此LEH类EHs有可能接受水以外的亲核试剂如N3－、NO2－、CN－、Cl－、Br－、I－、OCN－、SCN－、HCOO－等实现环氧开环，获得除二醇以外的其他产物［13］。

1.4 EHs的立体选择性

对于α/β水解酶折叠EHs和LEH类EHs，在水解外消旋环氧化物过程中同时存在对映选择性和区域选择性问题。特定的EH可能优先催化R型或S型底物的水解，存在对映选择性，可用于对消旋底物进行拆分(图2)。同时对于单独的R型底物，当EH进攻有取代的α碳原子时，产物构型发生翻转产生S型二醇，而当进攻无取代的β碳原子时，产物构型保留生成R型二醇。因此，当催化两种构型的底物以相反的位置选择性进行水解时，可实现对消旋环氧化物的对映归一性水解获得单一构型的二醇产物。这一过程可通过使用具有互补选择性的EHs或先后采用酶法和化学法催化环氧水解的方法实现。如利用Aspergillus niger和Bacillus suffurescens菌株可对氧化苯乙烯进行对映归一性水解获得89%e.e.和 92% 的收率［14］。而植物来源的土豆StEH［15］和绿豆 mbEH［16］分别可单独催化氧化苯乙烯和对硝基氧化苯乙烯的对映归一性水解。Furstoss等［17］利用 Aspergillus niger粗酶与酸水解的方法用消旋的对硝基氧化苯乙烯制备了相应的R型二醇，并最终以99%e.e.和58%收率合成了RNifénalol® 。

图2 EHs区域选择性Fig.2 Regioselectivity of epoxide hydrolases

2 新型EHs生物催化剂的开发

2.1 传统筛选方法

自20世纪90年代起人们对微生物来源的EHs进行了深入的研究，发现了大批能够选择性水解环氧化物的细菌、真菌菌株，解决了EHs的酶源问题。最初的筛选主要从已保藏的菌株出发检测其EHs活性，优先选择能够有效降解烯烃的菌株(能水解由此产生的环氧中间体)或能耐受环氧化物毒性的菌株。而以环氧底物作为唯一C源对土壤试样进行富集培养筛选或逐步提高底物浓度进行驯化筛选，可针对特定底物从自然界中广泛筛选EHs产生菌株。

自1993 年起，Mischitz等［18－19］筛选到一批具有环氧化物水解酶活性的细菌菌株，并做了一系列报道，包括大量菌株的底物谱鉴定、利用EHs进行制备规模的手性合成、EHs固定化、EHs催化的对映归一性水解等，充分证明了细菌EHs在有机合成中的应用潜力。法国的Zocher等［20］也针对产EHs的真菌菌株进行了相应的工作，其中Aspergillus niger表达的EHs此后被深入研究并已实现了商品化。Zocher等［20］测定了120株链霉菌对氧化苯乙烯的活性及选择性，从中筛选到Streptomyces antibioticus Tü4对映选择性E值达31，并且与大部分之前报道的菌株具有互补的对映选择性。国内最早由华东理工大学许建和课题组从土壤中筛选得到1株细菌Bacillusmegaterium ECU1001和 1株真菌Trichosporon loubierii ECU1040，它们对苯基缩水甘油醚具有互补的对映选择性，E值分别达到47.8和65.8［21－22］。山东大学 Li 等［23］利用 Pseudomonas sp.整细胞拆分3－苯基环氧乙烷甲酸乙酯达到了95%e.e.s和25%的收率。浙江工业大学郑裕国课题组分离得到的Rhodococcus sp.ML－0004菌株可用于催化水解顺式－环氧琥珀酸生产L－酒石酸［24］。至今为止，已有大量微生物菌株和植物被筛选到具有环氧水解酶活性，微生物主要来自于Agrobacterium、Aspergillus、 Bacillus、 Beauveria、 Corynebacterium、Pseudomonas、Rhodococcus、Rhodosporidium、Rhodotorula、Streptomyces、Trichosporon等属，植物来源包括了土豆、大豆、绿豆、拟南芥等。其中对 Agrobacterium radiobacter AD1、 Aspergillus niger、 Rhodococcus erythropolis、Solanum tuberosum、Rhodotorula glutinis等来源的EHs研究最为深入，目前均已进行了重组表达，并且Aspergillus niger EH已有商品酶销售。

2.2 基因工程挖掘方法

近20年来，人们已从自然界筛选得到了大量产EHs的微生物，但是由于野生菌表达的EHs往往只占其总蛋白的一小部分并且可能同时存在多个不同选择性的EHs，因而存在产酶活力低及对映体选择性不高等问题。对野生菌株进行产酶优化非常耗时，而且对酶进行分离纯化的过程易导致酶活损失。因此，人们把目光投向了如何获得高对映体选择性的EHs和高产EHs的菌株。随着生物信息学的发展、基因序列信息的积累以及基因工程技术的进步，快速获得新的EHs基因已成为可能。许多经典的 EHs都已被克隆并重组表达，如 Aspergillus niger、Agrobacterium radiobacter、Rhodococcus glutinis和Solanum tuberosum来源的EHs。随着EHs测序数量的增加，对其序列功能关系也有了更深入的了解，Barth等［25］分析了大量EHs序列与其结构的关系，为从基因数据库中挖掘更多不同催化性质的EHs提供了基础。表1列举了最近5年成功克隆表达的部分EHs及其基本催化性质。

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2.3 EHs分子改造

蛋白质工程通过定向进化或理性设计等方法可显著地改变酶的活性和选择性，而且可以扩大酶的适用底物范围，通过寻找新酶或应用新观点来扩大EHs作为生物催化剂的范围和性能，对扩充现有生物合成工具库非常有用。随着对环氧化物水解酶结构功能关系的更深入理解，结合可用于更高效构建突变体(库)的分子生物学方法和EHs活性的高通量检测技术，对EHs的定向进化与理性设计成为近几年EHs领域的研究热点。

已有相关综述讨论了 EHs的高通量筛选方法［3，35］，包括:① UV/VIS 分光光度法，简便快速，但该灵敏度不高;②通过NaIO4氧化二醇，结合分光光度法或荧光光度法，测定产物二醇的量;③ NBP(4-(p-nitrobenzyl)pyridine)法，NBP能与环氧化物反应生成紫色染料，可在600 nm处进行检测;④ Reetz等开发了用ESI－MS高通量测定EHs对映选择性的方法，以1∶1混合的(R)－PGE(phenyl glycidyl ether)与氘代(S)－PGE作为底物，反应后由于R和S构型的底物或产物存在质量差，因此其质谱结果可确定底物和产物的e.e.值，从而确定对映选择性;⑤ Loo等［35］以番红O为指示剂，在含1，2－环氧丁烷的琼脂平板上对定向进化的菌株的EHs活力进行筛选，通过菌落颜色挑选活性菌株。

Reetz等［36］最先针对AnEH的对映选择性进行了定向进化，通过一轮易错PCR并用ESI－MS进行高通量筛选，得到了突变体A217V/K332E/A390E，与WT(Wild type)相比对苯基缩水甘油醚的选择性(E值)由4.5提高到了10.8。最近他们又利用以LacZα作为报告蛋白的蓝色菌落筛选方法将AnEH的表达效率提高了近50倍。van Loo等［37］用易错PCR和同源重组的方法对ArEH进行了定向进化，产生的40000个克隆用番红花红O－琼脂糖平板筛选活性突变体，得到的8827个活性突变体利用分光光度法测定对pNPGE(对硝基苯基缩水甘油醚)的水解进程，通过转化率超过50%后其催化速率的下降程度来判定突变体的对映选择性，得到的突变体对映选择性最高达WT的13倍。

随着多个EHs晶体结构的陆续报道，通过定点突变对EHs进行理性或半理性设计也应用到了Aspergillus niger、Solanum tuberosum 和 Agrobacterium radiobacter EHs的分子改造中。Nardini等［38］将ArEH中参与底物结合与环氧开环的2个Tyr中的1个突变为Phe后使它对芳香类环氧化物的对映选择性提高了2～5倍。Thomaeus等［39］采取半理性设计的方法，在ArEH的活性位点周围选择了3个残基(Phe108，Ile219，Cys248)进行饱和突变，得到的突变体对二氯环氧乙烷的活性提高了2.5～7倍。对土豆中StEH活性位点附近质子传递链的突变Tyr149Phe和His153Phe，使它对反式二苯乙烯氧化物的对映选择性提高了30倍。Reetz等［40］开发的半理性设计方法CASTing(combinatorial active site saturation testing)，通过在活性位点附近按区域选择残基组合，分多轮重复进行组合饱和突变，与传统定向进化相比缩小了突变库，同时比理性设计具有更高的进化效率。他们将该方法应用于AnEH对映选择性的改造，最终将 E值由 WT的4.6提高至115。Kotik等［41］采用类似方法尝试对 Aspergillus niger M200 EH进行对映归一性水解能力的进化。通过5轮反复饱和突变，获得的突变体能将氧化苯乙烯或对氯氧化苯乙烯完全水解，e.e.值达到70%，将此突变体与WT结合使用可达到88%～91%e.e.。

2.4 笔者所在课题组在EHs开发中的研究进展

笔者所在课题组自1998年起开展了对环氧水解酶生物催化剂的开发及合成应用方面的研究工作(表2)，获得了一系列成果，包括针对缩水甘油苯基醚类底物从土壤中筛选到了具有互补对映选择性的产EHs菌株巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)ECU1001及路比利丝孢酵母(Trichosporon loubierii)ECU1040。从植物中筛选到的绿豆环氧水解酶具有罕见的对映归一性水解对硝基氧化苯乙烯的能力，可用于合成降血压药物R－Nifénalol®的手性前体。对于筛选得到的 EHs对其催化性能做了细致的表征，并通过产酶优化、酶或细胞固定化、反应体系优化等方式实现了在多种手性化合物合成中的应用。此外，近年来还成功克隆表达了来自Bacillus megaterium ECU1001和来自绿豆的环氧水解酶，大大提高了酶的生产能力。在此基础上，与上海有机所周佳海课题组合作，利用X－ray晶体衍射方法解析了这2个酶的三维结构。目前已通过结构指导的分子改造获得了对大位阻底物萘基缩水甘油醚具有高活性和对映选择性的突变体，并首次利用环氧水解酶对经典心血管药物普萘洛尔的合成前体进行了拆分，实现了(S)－普萘洛尔的克级制备。

表2 本课题组对环氧水解酶生物催化剂筛选与应用的研究成果Table 2 Progress of EHs screening and application

3 EHs的合成应用

3.1 底物溶解度问题

环氧水解酶应用过程中存在底物溶解度差(常温下往往低于5 g/L)和环氧底物会发生自发水解的问题。可通过提高助溶剂浓度或采用有机－水两相反应体系解决。如在组合利用AnEH粗酶和酸水解合成 R － Nifénalol® 的工艺路线［17］中，将助溶剂二甲基亚矾(DMSO)或DMT浓度提高到20%(体积分数)，解决了底物溶解度低的问题。Choi等［47］在用Aspergillus niger细胞干粉拆分外消旋时选择了仅含2%水的环己烷反应体系，虽然EH活性在有机溶剂的存在下有所降低，但由于解决了环氧氯丙烷自发水解的问题，使最终产量提高了10倍。Baldascini等［48］利用部分纯化 的 Agrobacterium radiobacter EHs，在辛烷/水两相体系，成功地将底物氧化苯乙烯的使用浓度提高到39 g/L，同时两相体系还有利于产物的下游分离纯化过程。

3.2 EHs稳定性问题

在引入有机溶剂及提高底物浓度的同时，往往会加快EHs的失活，因此提高EHs的稳定性也是其应用过程中需要解决的问题。在高底物浓度时重组表达EHs的整细胞具有相对更好的稳定性，Lee等［49］利用毕赤酵母表达了 Rhodococcus glutinis EHs，将它应用于500 mmol/L氧化苯乙烯的拆分，获得了98%e.e.和36%收率。此外，通过加入环糊精可以提高底物溶解度同时起到底物缓释的作用。通过加入200 g/L的羟丙基－β－环糊精(HPB)，苯乙烯氧化物在15℃的溶解度提高了7倍，同时不影响 Rhodococcus glutinis EHs的稳定性［50］。Jia 等［45］利用DEAE纤维素对Bacillus megaterium的EHs进行了固定化，固定化酶可循环使用10次。Genzel等［51］通过降低反应温度至4℃，利用AnEH合成了化学方法难以获得的(S)－2－，－3－，－4－环氧吡啶，同时他们还用纯水代替了缓冲液，简化了下游分离过程。Choi等［52］将 Rhodococcus glutinis EHs制成中空纤维膜反应器应用于两相拆分体系，降低了有机溶剂与底物对酶的失活作用，同时产物的及时移除解决了产物抑制问题。

4 总结及展望

EHs催化的手性环氧化物与二醇的合成路线为人们提供了一种可能取代化学方法的高效、专一、环境友好的合成方法。随着分子生物学和蛋白质工程技术的发展，传统的从保藏菌种和环境中筛选EHs的方法已逐渐被基因工程挖掘和蛋白质工程改造的方法所取代。大量来源于微生物、动物、植物的具有不同选择性和底物多样性的EHs已被克隆表达，为有机化学家提供了更多的选择。大量的基因信息更为我们提供了广阔的新酶开发空间，而包括定向进化和理性设计在内的蛋白质工程技术将使EHs更好地识别非天然底物，获得更高的活性和选择性。

自2000年以来，随着大量EHs表达菌株的发现及EHs基因的克隆表达，酶的大量获得已不再是限制其应用的主要因素。而进一步将EHs应用于工业生产，主要还受限于EHs的选择性及稳定性。相信对嗜热微生物来源的EHs的克隆表达、EHs选择性的分子改造以及对映归一性合成路线的构建将成为今后几年的研究热点。

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