枯草芽胞杆菌乙酰木聚糖酯酶的鉴定及诱导剂对酯酶活力的影响

田倩倩，宋 萍，陈 晨，林 明，江 凌，李 霜

(南京工业大学 生物与制药工程学院，南京 210009)

乙酰木聚糖酯酶(acetyl xylan esterase，缩写AXE)是一类可以将木聚糖或低聚木糖中酰基化的吡喃木糖去酰基化并释放出醋酸的酯酶，分类于羧酸酯酶家族Ⅶ，可以水解短链脂肪酸及各种酰基化化合物，具有广泛的底物特异性［1］。乙酰木聚糖酯酶在半纤维素木聚糖的降解中起着重要作用［2］;并且具有良好的酰基酯酶活性，可以催化7-氨基头孢烷酸和头孢菌素C脱酰基合成β-内酰胺类抗生素母核，具有巨大的工业应用价值［3］。

乙酰木聚糖酯酶产生菌种多为真菌，主要有Volvariella volvacea［4］、Trichoderma［5］，Aspergillus［6］，Penicillium［7］、 Schizophyllum［8］、 Rhodotorula［9］、Fusarium［10］和 Streptomyces［11］;细菌产生菌种主要为Bacillus［12］、 Thermobifida［13］、 Firobacter［14］和Thermoanaerobacterium［15］等。相对于真菌，细菌乙酰木聚糖酯酶种类相对较少，且酯酶活力较低［16］。

以一种高活力枯草芽胞杆菌乙酰木聚糖酯酶为研究对象，发现其相对分子质量不同于已报道的芽胞菌属乙酰木聚糖酯酶，并具有较短的发酵时间。因此考察诱导剂对乙酰木聚糖酯酶的影响，以期选择一种新的乙酰木聚糖酯酶活导剂来提高酶活力。

1 材料与方法

1.1 菌种

枯草芽胞杆菌CICC 20034(中国工业微生物菌种保藏中心)。对硝基苯酚乙酸酯、燕麦木聚糖、木糖等购自Sigma公司。

1.2 培养基

种子培养基 (g/L):蛋白胨 10、酵母粉 5、NaCl 10。

发酵产酶培养基(g/L):M9CA培养基，诱导剂添加量 0.5%［12］。

1.3 发酵培养

自斜面取1环菌接入装有50 mL种子培养基的三角瓶中，37℃、200 r/min培养6 h。以0.5%的接种量接入250 mL装50 mL发酵产酶培养基的三角瓶中，37℃、200 r/min发酵70 h。

1.4 蛋白质电泳

12.5%SDS-PAGE电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳参照文献［17］。低相对分子质量标准蛋白购于Takara公司。

1.5 酯酶染色

准确称取100 mg α-醋酸萘酯和100 mg β-醋酸萘酯，在2 mL丙酮中完全溶解，加入100 mg固蓝B，混合均匀。用0.1 mol/L pH 7.0磷酸缓冲液定容至100 mL。将胶置于摇床上缓慢摇动，37℃、55 r/min，染色 1.5 h［18］。

1.6 非解聚的聚丙烯酰胺凝胶电泳

非解聚聚丙烯酰胺电泳参照Rousselot等［19］的方法。上样缓冲(pH 6.8):0.16 mol/L Tris，7.95%SDS，25.5% 甘油，0.05%溴酚蓝。处理好的试样40℃ 水浴5 min，80/120 V SDS-PAGE电泳，电泳后水洗胶10 min，置于体积分数0.5%TritonX-100的Tris-HCl(100 mmol/L，pH 7.5)缓冲液中过夜复性，酯酶同工酶染色，得到酯酶染色条带，水洗后进行考马斯亮蓝染色。

1.7 乙酰木聚糖酯酶活力的测定

以对硝基苯酚醋酸酯为底物，410 nm下检测酶水解底物产生的对硝基苯酚的吸光值，测定方法参照文献［12］。1个单位酶活定义为标准条件下，每分钟水解产生1 μmol对硝基苯酚所需的酶量。

2 结果与讨论

2.1 枯草芽胞杆菌酯酶同工酶

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳及酯酶同工酶染色对发酵后的上清液进行电泳分析，表明枯草芽胞杆菌可分泌一种酯酶(图1)。

图1 枯草芽胞杆菌粗酶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳Fig.1 Native PAGE analysis of the culture supernatant from Bacillus subtilis.

采用非解聚丙烯酰胺凝胶电泳和酯酶染色与考马斯亮蓝染色结合染色法确定酯酶相对分子质量，试样的处理和电泳方法按照文献［19］。试样未经煮沸，未加入巯基乙醇，电泳过程在冰浴中进行，以确保酯酶处于聚合状态，结果见图2。由图2可知，酯酶相对分子质量为1.07×105。

2.2 枯草芽胞杆菌脂肪酶Ⅰ氨基酸序列的鉴定

图2 枯草芽胞杆菌脂肪酶相对分子质量Fig.2 Molecular weight of esterase 1 from Bacillus subtilis

将鉴定枯草芽胞杆菌CICC 20034酯酶的电泳条带切下(图2，泳道2中相应的酯酶条带)，对其进行蛋白质质谱鉴定(LC-MS/MS)。经蛋白质质谱专用搜索系统Mascot搜索得到的蛋白鉴定结果如表1所示。该酯酶蛋白与乙酰木聚糖酯酶的蛋白分数为655(远大于阀值53)，二级覆盖率达到34%，氨基酸序列与解淀粉芽胞杆菌FZB42的乙酰木聚糖酯酶最为接近(表1和图3)。乙酰木聚糖酯酶活力的测定多以醋酸酯(对硝基苯酚醋酸酯、醋酸萘酯)为反应底物，本研究中酯酶对醋酸萘酯的高活性(图1)与蛋白鉴定结果相一致。

解淀粉芽胞杆菌FZB42的单体相对分子质量为3.56×104，而天然状态下枯草芽胞杆菌酯酶的相对分子质量为1.07×105，表明该酯酶自然状态下很可能为多聚体。现今，解淀粉芽胞杆菌FZB42(芽胞杆菌亚种916及芽胞杆菌亚种5B6)的乙酰木聚糖酯酶并未表征。Bacillus subtilis 168(GenBank:NP_388200.1 )、Bacillussubtilis ATCC6633(GenBank:ZP_06875135.1)、Bacillus pumilus(GenBank:2XLC_A)的乙酰木聚糖酯酶在自然状态下分别为六聚体、单体、六聚体，相对分子质量分别为2.20 ×105、4.5 ×105和1.90 ×105［12，20-21］。枯草芽胞杆菌CICC 20034乙酰木聚糖酯酶具有相对分子质量1.07×105。与已报道的酯酶有显著的差异，值得进一步表征和深入研究。

表1 枯草芽胞杆菌CICC 20034酯酶Ⅰ的蛋白质谱鉴定Table 1 Identification of esteraseⅠfrom Bacillus subtilis CICC 20034 via protein mass spectrometry

图3 枯草芽胞杆菌CICC 20034酯酶Ⅰ的蛋白质谱鉴定Fig.3 Identification of esterase Ⅰ from Bacillus subtilis CICC 20034 by protein mass spectrometry

2.3 诱导剂对枯草芽胞杆菌酯酶活性的影响

乙酰木聚糖酯酶为木聚糖降解酶系中的一员，天然木聚糖及其降解物，如木聚糖、壳聚糖、玉米芯粉、木糖等［11-12］可以诱导乙酰木聚糖酯酶的合成。常见诱导剂及短链脂肪酸酯——乙酸乙酯(C2∶0)、三丁酸甘油酯(C4∶0)对枯草芽胞杆菌CICC 20034产胞外酯酶活力的作用，结果如图4所示。由图4可知:不添加任何诱导剂时，枯草芽胞杆菌CICC 20034可组成型表达一定量的酯酶，比酶活为0.23 U/mL;添加木聚糖、壳聚糖、玉米芯粉和三丁酸甘油酯对发酵产酶几乎无诱导作用;乙酸乙酯为最佳诱导剂，体积酶活为0.62 U/mL;木糖也有显著的诱导作用，酯酶体积酶活为0.46 U/mL，比不添加诱导剂酶活力分别提高了169%和100%。已报道的野生细菌产乙酰木聚糖酯酶的能力如表2所示，本研究中枯草芽胞杆菌体积酶活0.62 U/mL，CICC20034产乙酰木聚糖酯酶为现今报道的野生细菌乙酰木聚糖酯酶达到最高活性，以后可通过构建工程菌来进一步提高活力。

表2 细菌乙酰木聚糖酯酶的发酵活力Table 2 Production of acetyl xylan esterases from bacteria

图4 诱导剂对枯草芽胞杆菌CICC 20034酯酶Ⅰ活性的影响Fig.4 Effects of inducers on activity of esterase Ⅰfrom Bacillus subtilis CICC 20034

枯草芽胞杆菌CICC 20034的发酵产酶曲线如图5所示。由图5可知:发酵体系中无诱导剂存在时，发酵前期(0～20 h)产酶很不稳定，后期产酶需要发酵时间较长(＞50 h)。以乙酸乙酯和木糖为诱导剂后，酯酶可以稳定合成，产酶时间提前至30～50 h。而Degrassi等［12］报道的野生短小芽胞杆菌乙酰木聚糖酯酶发酵产酶时间集中于40～72 h。

图5 枯草芽胞杆菌CICC 20034发酵产酶曲线Fig.5 Time course of esterase Ⅰ production by Bacillus subtilis CICC 20034

3 结论

枯草芽胞杆菌CICC 20034可分泌一种高相对分子质量的酯酶，自然状态下相对分子质量为1.07×105，经蛋白质质谱鉴定为乙酰木聚糖酯酶，单体相对分子质量为3.56×104，乙酸乙酯为枯草芽胞杆菌CICC 20034产乙酰木聚糖酯酶的最佳诱导剂，发酵液中酯酶体积酶活为0.62 U/mL，为已知报道的野生细菌乙酰木聚糖酯酶的最高酶活。枯草芽胞杆菌CICC 20034乙酰木聚糖酯酶具有鲜见报道的相对分子质量特征和高酯酶活性，具有广阔的应用和研究前景。

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