来自Staphylococcus aureus N315的2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶的工程菌构建、表达纯化与性质鉴定

韩 磊，陈 曦，冯进辉，吴洽庆，朱敦明

(中国科学院 天津工业生物技术研究所 工业酶国家工程实验室，天津 300308)

酶因其高选择性、反应温和等特点而被逐渐地应用于绿色化工生产过程中。醛缩酶能立体选择性地催化C—C键的形成，可作为手性分子工业合成的重要工具［1］。2－脱氧－d－核糖5－磷酸醛缩酶(2-deoxy-d-ribose 5-phosphate aldolase，DERA，EC 4.1.2.4)是目前发现的唯一一种乙醛依赖型的醛缩酶。在生物体内，DERA可逆地催化其天然底物乙醛和d－甘油醛－3－磷酸发生醛缩反应而生成2－脱氧－d－核糖－5磷酸，参与多种微生物的DNA代谢途径［2］。该酶属于I类醛缩酶，不需要辅因子，均以一个保守的赖氨酸为活性位点［3］。

DERA具有较宽的底物谱［4］。除了乙醛外，DERA还能够以丙醛、丙酮、氟代丙酮作供体［4］。新形成的立体中心的构型完全由DERA决定并且通常是S构型。DERA是唯一一种能催化乙醛的自缩合或和醛类物质之间的交叉缩合的醛缩酶，这使其备受关注。因为供体与受体都是醛，以乙醛作供体的缩合产物也可作为进一步缩合的受体底物，从而在醛缩底物上引入多个手性中心，二次缩合的产物可以生成稳定的半缩醛而阻止了进一步缩合［5］。该特点使它成为合成多种稀有糖和糖衍生物的有力工具。

连续缩合产物可以用于合成他汀类药物(statin)的手性侧链前体［6－9］，这一反应过程以廉价的、非手性的材料为底物，具有广阔的应用前景。

随着对DERA应用价值的认识不断加深，越来越多的编码DERA的基因(deoC)被克隆、测序和表达。这些已报道的DERA分别来源于Aeropyrum pernix(登录号为 BAA81452，下同)［10］、Escherichia coli K12(CAA26974)［11］、Paenibacillus sp.EA001(ACT313388)［12］、Pyrobaculum aerophilum(AAL63-340)［13］，Thermococcus kodakaraensis KOD1(BAC677-08)［14］、Thermotoga maritima(AAD36625)［13］、Yersinia sp.EA015(ACN71238)［15］。然而，通常都存在可溶表达量低、稳定性差以及活力较低的缺点。因此，得到一种高表达量、高稳定性的、高活力的DERA就尤为重要。本研究表达、纯化一种来自Staphylococcus aureus N315的 DERA(SaDERA)，并研究其相关性质。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌株及主要试剂

pET－28a(+)质粒载体和E.coli BL21(DE3)感受态细胞购自Novagen公司。FastDigest®限制性内切酶购自Fermentas公司。蛋白胨和酵母提取物均来自BD公司。Bradford蛋白浓度试剂盒购自康世纪公司。考马斯亮蓝 R250购自 Solarbio公司。NADH购自Codexis公司。d－2－脱氧核糖－5－磷酸(DR5P)、磷酸丙糖异构酶和甘油磷酸脱氢酶混合液(GPD/TPI，来自兔肌肉组织)购自 Sigma-Aldrich公司。40%乙醛水溶液购自国药集团。其余试剂均为市售分析纯。

1.1.2 主要仪器设备

ZHWY－200D恒温培养振荡器(上海智城公司);SW－CJ－1FD超净工作台(苏净安泰公司);APV2000高压匀浆破碎仪(德国APV公司);RC6+高速冷冻离心机(Thermo公司)。蛋白纯化及全酶相对分子质量测定均在GE公司的AKTA Purifier 10蛋白分离纯化系统上进行。SpectraMax® M2e酶标仪购自Molecular Devices公司;microTOF－QII型质谱(MS)分析仪、数据采集软件microTOFcontrol及数据处理软件DataAnalysis均购自Bruker公司。

1.2 基因挖掘

1.2.1 数据库挖掘及生物信息学分析

在美国国立生物技术信息中心(NCBI)的蛋白数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)中，以“2-deoxy-d-ribose 5-phosphate aldolase”或“deoxyribose phosphate aldolase”为检索词，并以“bacteria”为限定，确定候选的DERA。通过在ExPASy的ProtParam程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)上计算候选酶的理论理化特性，排除含半胱氨酸个数较多或是奇数的(可能影响可溶性)和预测可溶性低的。通过BioEdit分析软件(版本7.0.9)的 ClusterW 多序列比对，分析候选的DERA的保守序列，最终确定以一种来自于Staphylococcus aureus N315的DERA为研究对象(命名为SaDERA)，其氨基酸参考序列的登录号为BAB43223。

1.2.2 密码子优化和基因合成

通过在线的jcat密码子优化程序(http://www.jcat.de)对SaDERA的原始基因序列进行了针对在E.coli中表达的密码子优化，然后在N端加上了His6标签。在确定了基因两端的限制酶识别位之后由上海旭冠生物科技发展有限公司合成。

1.3 工程菌的构建及目的酶的表达纯化

1.3.1 工程菌的构建

质粒的提取、酶切、转化、核酸凝胶电泳、基因的诱导表达及SDS－PAGE等实验操作均按照文献［16］进行。目的基因构建至pET－28a(+)质粒载体的NcoI和EcoR I两酶切位点之间，转化至E.coli BL21(DE3)超级感受态细菌中。

1.3.2 目的酶的表达纯化

将工程菌接入800 mL含终浓度为100 μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养(200 r/min)至 OD600为 1.0时，添加终浓度为 1 mmol/L的IPTG进行诱导表达(4 h、37℃)。离心(4℃、6000 r/min、10 min)收菌，并用4℃预冷的缓冲液 A(20 mmol/L Tris-HCl、pH 8.0、500 mmol/L NaCl)洗涤菌体，－20℃保存。

以50 mL缓冲液A重悬菌体后，进行高压匀浆破菌，离心(12000 r/min、4 ℃、15 min)除去细胞碎片。上清液(即粗酶液，简称CFE)在用0.22 μm的滤膜(Millipore)过滤后通过HisTrapTMFast Flow层析柱(GE Healthcare，5 mL)进行一步纯化。用10%缓冲液B(含0.2 mol/L咪唑的缓冲液A)平衡柱子，上样后用10%的缓冲液B冲洗，待紫外检测出现基线时，用10% ～100%的缓冲液B进行线性洗脱(6个体积)。收集合并目的蛋白后，通过超滤管进行浓缩脱盐并添加终体积分数为10%的甘油。过膜分装后，于－80℃保存。

1.4 酶学性质研究

1.4.1 活性分析方法

DERA的活性测定通过GPD/TPI耦联的方法在酶标仪上进行。DR5P在DERA催化下裂解产生的G3P能被GPD/TPI还原而消耗NADH，引起340 nm波长下的吸光度下降(ε =6.22 mmol－1·cm－1)。由于GPD/TPI过量，此下降速率与G3P的生成速率一致。通常，这个耦联反应在25℃下进行，反应体系:100 mmol/L Tris－HCl缓冲液(pH 7.7)、1 mmol/L的DR5P、2 U的 GPD/TPI和0.35 mmol/L的 NADH 以及适量的SaDERA。吸光度的变化被连续检测5 min以确定初始反应速率。1个酶活力单位(U)被定义为在上述检测条件下，每分钟裂解1 μmol的DR5P而生成1 μmol的G3P所需的酶量。

1.4.2 相对分子质量的测定

SaDERA的相对分子质量及其在溶液中的聚集状态通过SDS－PAGE以及分子筛来确定。所用分子筛为Superdex 20010/300 GL(GE公司)。流动相为含有150 mmol/L NaCl的20 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)，流速为0.4 mL/min。蛋白的相对分子质量由标准蛋白的保留体积进行计算得到。标准蛋白分别为Ovalbumin(4.4×104)、Conalbumin(7.5×104)、Conalbumin(1.58 × 105)、Ferritin(4.40 × 105)、Thyroglobulin(6.69×105)。

1.4.3 最适反应条件

最适反应条件按裂解和缩合的活性分析方法来测定。对于最适反应 pH，所用缓冲体系(100 mmol/L)为NaAc－HAc(pH 4.0～6.0)、Na2HPO4－NaH2PO4(pH 6.0～7.0)、Tris－HCl(pH 7.0～9.5)和Na2CO3－NaHCO3(pH 9.5～11.0)。对于最适反应温度，反应在25～65℃下进行。

1.4.4 动力学参数

动力学参数按裂解和缩合的活性分析方法来测定，只是DR5P选取不同浓度(0.4～8 mmol/L)。表观动力学参数(Km和Vmax)及其误差由SigmaPlot v12.2的线性拟合功能得到。

1.5 稳定性分析

1.5.1 pH稳定性

对于pH耐受性，所用缓冲体系与最适pH测定时相同。存在于不同pH缓冲液中的酶溶液(0.5 mg/mL)的酶在25℃下温浴24 h后，测定其残存活力。

1.5.2 热稳定性

对于温度耐受性，存在于100 mmol/L Tris－HCl缓冲液(pH 7.7)中的酶溶液(0.5 mg/mL)在不同温度下(4～65℃)温浴10 min后测定其残存活力。为测定SaDERA在最适反应温度(45℃)下的活力半衰期，小份酶液(20 μL)在不同的时间点取出并测定其残余活力。

1.5.3 乙醛耐受性

为检测 SaDERA对乙醛的耐受性，含有100 mmol/L Tris－HCl缓冲液(pH 7.7)和300 mmol/L乙醛的酶溶液(0.5 mg/mL)在25℃下温浴。在不同的时间取出小份酶液(20 μL)并通过微型超滤管(Amicon Ultra 0.5 mL，Ultracel 10k)除去乙醛［13］。在用100 mmol/L Tris－HCl(pH 7.7)稀释到原体积之后，测定其残余活力。

1.6 连续缩合反应及产物鉴定

1.6.1 分析方法

薄层层析(TLC)条件:展层剂为乙酸乙酯(EA);显色剂为茴香醛显色剂(V(茴香醛)∶V(浓H2SO4)∶V(H2O)=5∶10∶85);火上烘烤显色。连续缩合产物2，4，6－三脱氧己糖的比移值约为0.5，显灰绿色。

MS条件:电喷雾电离源正离子模式(ESI+)，选择反应监视(SRM)扫描模式，喷雾电压4.5 kV，雾化气流量6 L/min，离子传输毛细管温度180℃，碰撞气为N2，扫描频率1.0 Hz。

1.6.2 连续缩合反应及产物鉴定

反应溶液(10 mL):100 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.4)，0.3 mol/L乙醛，8 mg纯酶。反应条件:25℃水浴，100 r/min振摇。以TLC监视反应进程，3 d后结束反应。加2倍体积的丙酮终止反应后，冰上静置15 min，离心除去蛋白。40℃下减压旋蒸反应液至1 mL，用制备TLC进行纯化。刮下的产物用乙酸乙酯(EA)重溶后，过滤，蒸干。取0.25 mg溶于1 mL milli－Q水中，进样到MS以检测其相对分子质量。

2 结果与讨论

2.1 生物信息学分析

SaDERA(登录号BAB43223)由220个氨基酸残基组成。由ExPASy网站上的ProtParam功能知:SaDERA的理论相对分子质量为2.334×105，理论pI为4.71。氨基酸多序列比对(图1)结果显示，SaDERA 与 来 源 于 Paenibacillussp.EA001(PaeDERA)［12］，Thermococcus kodakaraensis KOD1(TkDERA)［14］、Yersinia sp.EA015(YerDERA)［15］、Thermotogamaritima(TmDERA)［13］、Pyrobaculum aerophilum (PaDERA)［13］、 Aeropyrum pernix(ApDERA)［10］和 Escherichia coli K12(EcDERA)［11］的 DERAs序列一致性分别为 64.0%、51.7%、51.5%、47.3%、29.0%、28.5%和27.4%。

图1 SaDERA与已知的DERAs的多序列比对Fig.1 Multiple sequence alignment for SaDERA and the other reported DERAs

EcDERA中涉及形成Schiff碱调节羟醛缩合反应的关键残基(Asp102、Lys167和 Lys201)在SaDERA中完全保守(分别对应 Asp89、Lys151和Lys180)。在EcDERA中，Lys167与底物形成Schiff碱，而在立体空间中Lys167接近的Asp102、Lys201涉及供体醛的立体选择性的质子化转移过程［17］。因此，推断SaDERA可能具有催化能力。

Desantis等［18］报道了EcDERA的磷酸结合口袋由 Gly171、Lys172、Gly204、Gly205、Val206、Arg207、Ser238和Ser239组成。而在SaDERA中，对应的残基依 次 是 Gly155、Phe156、Gly183、Gly184、Val185、Arg186、Thr200和 Arg201。156(按 SaDERA 编号，下同)位的氨基酸残基由碱性的Lys置换为疏水的Phe，增加了磷酸结合口袋的疏水性;238位的氨基酸残基由Ser置换为链更长的Thr，而增大了磷酸结合口袋的空间位阻;201位的氨基酸残基由中性的Ser置换为碱性的Arg，改变了磷酸结合口袋的静电环境。这些改变将使得SaDERA与非磷酸取代的醛类化合物的结合能力增强，从而有助于连续缩合反应的进行。

2.2 重组SaDERA的表达纯化

SaDERA具有良好的可溶性，37℃诱导即可表达出大量可溶蛋白。由图2可知，由于SaDERA带了His6标签，通过一步简单的镍柱纯化即可得到电泳纯的目的酶(图2，泳道PE)。

图2 SaDERA的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of SaDERA

SaDERA纯酶的比酶活是118.9 U/mg(表1)，是相同条件下来自PaeDERA的比酶活(62 U/mg)的 2 倍［12］。

2.3 SaDERA亚基数

通过凝胶过滤层析(Superdex 20010/300 GL)，SaDERA的保留体积为14.1 mL，因此SaDERA全酶的相对分子质量约为5.57×104。由SDS-PAGE知，其单体相对分子质量为2.55×104，所以该酶在溶液中以同源二聚体形式存在，此结果与已报道的DERA的亚基数一致。

表1 SaDERA的蛋白纯化过程Table 1 Purification of target enzyme

2.4 基本酶学性质

SaDERA的酶学性质分析如图3所示。由图3(a)和图3(b)可知:SaDERA最适反应条件为pH 7.7。它能在一个较宽的pH范围(6.5～9.5)内呈现出相对较高的反应活力(最适活力的80%以上)。另外，SaDERA在相同pH的不同缓冲液下的活性相似，因此，缓冲液的差别对活性影响不大。

由图3(c)和图3(d)可知:SaDERA能稳定地存在于中性或偏碱性的环境中，而且具有相当高的碱耐受性，在pH 11.0的缓冲液(100 mmol/L)中25℃温浴24 h后仍有93%的残余活力。SaDERA具有良好的耐热性，在40℃温浴10 min后能保持几乎全部活力，然而随着温度继续升高，其残余活力逐渐减小。

2.5 乙醛耐受性

乙醛耐受性的实验结果如图4所示，由图4可知:该酶在0.3 mol/L乙醛浓度下，30 min内保持了高于70%的残余活力，在2 h后，其剩余活力仍大于50%，到达6 h后剩余活力下降为约40%，其后至24 h不再出现明显下降。从其活力下降的曲线可以看到，在1 h内，活力下降速度最高，1 h内下降了约60%，但是之后变化逐渐放缓，这表明随着时间的延长，大量的乙醛底物被醛缩酶催化生成缩合产物，降低了变性剂乙醛的浓度，进而导致酶失活速率的下降。这一结果与嗜热来源的PaDERA和TmDERA相似，并且都远优于常温来源的EcDERA:SaDERA在实验条件下温浴2 h后能保持54%的原活力;PaDERA和TmDERA在同样的条件下温浴2 h后保持60% ～70%的原活力，EcDERA在同样的条件下温浴2 h后几乎完全丧失活力［12］。这表明SaDERA有潜力替代研究最充分的EcNAL而成为有价值的工业催化剂。

图3 SaDERA的酶学性质分析Fig.3 Characterization of the purified SaDERA

图4 SaDERA的乙醛耐受性Fig.4 Effects of acetaldehyde on enzyme stability

2.6 动力学参数

SaDERA的表观动力学参数也被测定，结果如表2所示。由表2可知:SaDER的 kcat/Km为175 L/(mmol·s)，这与研究最充分的高活力的EcDERA相似［18］，而与已报道的 PaeDERA［12］具有同样较高的乙醛耐受。这显示出SaDEAR具有一定的应用潜力。

2.7 连续缩合反应及产物鉴定

为了进一步确定SaDERA的连续羟醛缩合的性能，以乙醛为底物进行了连续羟醛缩合反应，并通过制备TLC进行了产物纯化和质谱检测。结果如图5所示。由图5(a)可知:在25℃下反应20 h后即有大量产物生成，而EcDERA却几乎检测不到产物的生成［12］。由图5(b)可知:产物为2，4，6 － 三脱氧己糖(C6H12O3)，即乙醛连续两次自缩合的产物，单一同位素的理论质荷比(m/z)为132.0786，理论加钠峰为155.0684，实测为155.0640。分离产率39.5%。结果表明SaDERA具有催化连续羟醛反应的能力，而且明显优于研究最充分的EcDERA。

表2 SaDERA与其他DERAs的表观动力学参数Table 2 Apparent kinetics parameters of SaDERA and the other DERAs

图5 缩合产物鉴定Fig.5 Identification of aldol product

3 结论

采用基因挖掘技术，一种来自Staphylococcus aureus N315的DERA被发现并进行了鉴定。SaDERA具有一些明显的优势，如乙醛耐受性强、耐碱、催化活性高、可溶表达量高;应特别指出的是，SaDERA具有比已商业化的EcDERA更强的乙醛耐受性以及比其他一些已报道的DERA更高的比活力或kcat/Km值。SaDERA及构建的工程菌有可能成为一种新的工业催化剂。随着生物催化技术应用和发展，获得宽底物谱、高稳定性、高立体选择性的新型DERA将是今后的研究重点。

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