鼻腔滴入胰岛素改善2型糖尿病大鼠海马阿尔茨海默病样改变*

杨 雁， 马德琳， 王玉萍， 姜 腾， 胡蜀红， 余学锋

(华中科技大学同济医学院附属同济医院内分泌科， 湖北 武汉 430030)

鼻腔滴入胰岛素改善2型糖尿病大鼠海马阿尔茨海默病样改变*

杨 雁， 马德琳， 王玉萍， 姜 腾， 胡蜀红， 余学锋△

(华中科技大学同济医学院附属同济医院内分泌科， 湖北 武汉 430030)

目的2型糖尿病(type 2 diabetes, T2D)时大脑出现胰岛素水平下降及胰岛素信号通路下调，使大脑海马tau蛋白出现过度磷酸化的阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)样改变。本研究选取2型糖尿病大鼠，皮下注射及鼻腔滴入胰岛素，观察大脑AD样病变的改变，并探讨其机制。方法高糖、高脂、高蛋白喂饲3个月后链脲佐菌素腹腔注射制备T2D大鼠模型。运用2种方法干预：鼻腔滴入胰岛素(T2D+I-I)及皮下注射胰岛素(T2D+S-I)。检测血浆葡萄糖、血浆胰岛素和脑脊液胰岛素水平，免疫印记方法检测大脑海马总tau蛋白和tau蛋白部分位点磷酸化状态、胰岛素信号转导途径中关键酶磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/Akt及糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β)活性。结果T2D组大鼠血浆葡萄糖及胰岛素水平显著升高，脑脊液胰岛素水平显著降低，大脑海马组织中tau蛋白呈过度磷酸化状态，PI3K/Akt活性下降， GSK-3β磷酸化水平升高； T2D+I-I组大鼠血浆胰岛素及葡萄糖水平无显著改变，但大脑海马tau蛋白过度磷酸化状态显著好转，PI3K/Akt活性显著升高，GSK-3β活性显著下降； T2D+S-I组大鼠血糖显著下降，但血浆及脑脊液胰岛素水平无显著改变，大脑海马tau蛋白磷酸化水平有轻度改善，但变化不显著。结论运用鼻腔滴入胰岛素可减轻T2D时大脑海马组织的AD样病变；外周皮下胰岛素注射对T2D时AD样病变无明显作用。

阿尔茨海默病； 2型糖尿病； 胰岛素； Tau蛋白过度磷酸化； 胰岛素信号途径

2型糖尿病(type 2 diabetes, T2D)是最常见的内分泌代谢病。阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)是一种神经退行性疾病，占成人痴呆症的60%[1]。随着人们生活方式的改变(能量摄入增加和运动减少等)及人口老龄化，T2D及AD患者人数急剧上升。流行病学资料显示，T2D人群较非T2D人群发生AD的风险要上升1.5～2.5倍[2-3]。因此，探讨T2D时导致AD发病风险增高的原因并寻求有效的治疗药物具有重要临床意义。

AD最早出现的典型病理生理改变是大脑海马组织中tau蛋白过度磷酸化形成的神经纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)和淀粉样β肽(amyloid β-peptide, Aβ)聚集形成老年斑，其中tau蛋白过度磷酸化由于先于Aβ聚集出现，被称为AD样(AD-like)改变[4]。有研究发现在8周龄的糖尿病模型db/db小鼠中，大脑海马tau蛋白已呈过度磷酸化的AD样改变，并且这种改变随着小鼠周龄的增长而逐渐加重[5]。Tau蛋白磷酸化状态受蛋白激酶与蛋白磷酸酶的双重调节，其中糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β)是tau蛋白的重要磷酸激酶，其活性上升可导致tau蛋白上大多数位点发生过度磷酸化改变[5-6]。

T2D特征性表现为高胰岛素血症、外周组织胰岛素抵抗和血葡萄糖产生增加。我们前期的研究及国外的研究证实： (1)T2D时，大脑组织呈AD样病变[7]；(2)大脑海马细胞内GSK-3β活性上升，导致大脑海马内tau蛋白出现过度磷酸化，促进AD的发生[8]；(3)T2D时，虽然外周胰岛素水平显著升高，但大脑胰岛素水平却没有升高，反而出现下降，这可能与血脑屏障对胰岛素的转运下降有关[9-10]；(4)T2D时，大脑胰岛素信号途径中重要组成部分磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/Akt活性下降，从而导致其下游即tau蛋白磷酸激酶GSK-3β活性反馈性增高[11-12]。以上实验结果表明，大脑胰岛素水平的下降和胰岛素信号途径的激活减弱是导致T2D时AD形成的重要因素之一，因此，改善下降的大脑胰岛素水平及增强胰岛素信号通路可能是减少T2D时AD发病的重要靶点之一。

本研究选取2型糖尿病大鼠，通过皮下注射胰岛素或鼻腔滴入胰岛素2种方式改善大脑胰岛素水平，通过检测干预前后大脑海马tau蛋白磷酸化水平及胰岛素信号转导途径中各酶活性，来探讨T2D时大脑胰岛素水平异常作为AD发病重要风险因素的原因。本研究将对降低T2D患者AD发病风险的治疗有重要意义。

材 料 和 方 法

1动物模型

1.1T2D大鼠模型的制备 雄性SD大鼠(华中科技大学同济医学院动物中心提供)54只，体重150～180 g，10～12周龄，其中随机42只给予高脂高糖高蛋白饮食[热卡百分比为碳水化合物26%，蛋白质15.2%，脂肪(炼猪油)58.8%] 3个月，按照30～35 mg/kg剂量尾静脉一次性注射STZ(Sigma，粉剂溶于0.1 mol/L pH 4.3柠檬酸钠缓冲液中)，72 h后尾静脉取血，血糖仪(强生稳豪)测血糖≥16.7 mmol/L、尿糖持续阳性为造模成功，42只高脂高糖高蛋白饮食+STZ小剂量注射大鼠中，36只血糖高于入选标准，纳入2型糖尿病组(T2D组)。另外12只给予普通饮食喂养，并按照上述方法尾静脉注射柠檬酸缓冲液(CTL组)。

1.2T2D大鼠胰岛素干预 随机将36只T2D大鼠分为3组，均继续高脂高糖高蛋白饮食，11只给予皮下胰岛素注射(subcutaneous insulin injection，S-I)，剂量为0.1 U/kg(T2D+S-I,n=11)，每天1次。12只给予鼻腔滴入胰岛素(intranasal insulin treatment，T2D+I-I,n=12)，按照Dhuria等[13]的方法，麻醉大鼠，取仰卧位，将大鼠头部与身体角度处于70～90度，将胰岛素通过移液器送入鼻腔，胰岛素浓度为4×104U/L，每次每只大鼠用量1 U,即25 μL， 5 μL交替滴鼻，共滴5次，每次间隔1 min，每天给药1次。T2D+S-I组及T2D+I-I组均空腹过夜， 8:00 AM给予胰岛素后即可进食。胰岛素种类均使用短效胰岛素(诺和灵R，诺和诺德天津制药有限公司)。未经胰岛素干预的T2D组大鼠(n=13)给予25 μL生理盐水滴鼻，每次5 μL，共滴5次，每次间隔1 min。干预4周以后，与进食普通饲料的CTL大鼠同时断颈处死。

实验过程中，大鼠单笼饲养于恒温(25 ℃)的清洁级动物房中，每天光照12 h，T2D组、T2D+I-I组及T2D+S-I组给予胰岛素或生理盐水干预后投食，CTL组大鼠可自由进食。各组大鼠自由饮水，除胰岛素干预外未经任何降糖药物处理。

2观察指标及方法

2.1一般指标

2.1.1血糖(plasma glucose) 处死前由尾静脉采血，用血糖仪检测血糖水平。

2.1.2血浆胰岛素(plasma insulin) 处死前心脏取血1mL，离心后取血浆，-20℃保存，放免法1次性检测。试剂盒购自北京原子能研究所， 测定值批内CV<2.5%，批间CV<3.5%。

2.1.3胰岛素抵抗指标 以稳态模型的胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment of insulin resis-tance,HOMA-IR)表示,HOMA-IR=FINS(fasting insulin, U/L)×FPG (fasting plasma glucose, mmol/L)/22.5。

2.1.4脑脊液胰岛素 (cerebrospinal fluid insulin，CSF insulin) 参照Hoistad等[14]的方法，运用20%乌拉坦将大鼠麻醉以后，剪开头部皮肤，清理组织和肌肉，暴露小脑及延髓部，运用注射器针头在脑膜上开孔，向内插入细管，将细管末端低于头部，等待脑脊液自动流出，收集20～50 μL以检测脑脊液胰岛素水平。

2.2蛋白质印迹方法分析各组大鼠大脑海马组织内总tau蛋白和tau蛋白部分位点的磷酸化水平,胰岛素信号转导途径中总Akt、磷酸化Akt、总GSK-3β及磷酸化GSK-3β的水平 处死动物，取出一侧大脑海马组织。一部分放入匀浆器内，加入蛋白质提取液，冰上匀浆。蛋白质提取液:40 mmol/L Tris-HCl， pH 7.0，1% Triton X-100，0.2% SDS，1.0 mmol/L脱氧胆酸钠，1.0 mmol/L Na3VO4，50 mmol/L NaF， 1.0 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)，2.0 mg/L抑肽酶(aprotinin)、 亮抑蛋白酶肽(leupeptin)和抑肽素(pepstatin)，1.0 mmol/L EGTA,1.0 mmol/L EDTA(以上试剂购自武汉凌飞科技公司)。于4 ℃、12 000×g离心10 min，取上清即为蛋白质。取10 μL用Bradford法检测蛋白质浓度，余储存于-80 ℃备用。用前加2×样本缓冲液并混匀，于100 ℃变性5 min。每孔内加入约12 μg蛋白，10%SDS-PAGE电泳，结束后全湿转至NC膜。摇床上5%BSA封闭2 h；杂交Ⅰ抗(所有抗体如表1所示)4 ℃过夜；PBST洗膜3次，每次10 min；杂交Ⅱ抗(辣根酶标记的羊抗兔、羊抗鼠及兔抗羊IgG购自Pierce)，室温摇床上1 h；PBST洗膜3次，每次10 min； ECL显色，最后用胶片感光。运用BandScan 5.0软件对免疫反应条带进行定量分析。

表1 研究所用Ⅰ抗

p-tau: phosphorylated tau; NP-tau: non-phosphorylated tau.

3统计学处理

用Prism 4.0进行统计处理。计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，各组均数间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有显著意义。

结 果

1各组大鼠血糖、血浆胰岛素、脑脊液胰岛素水平及胰岛素抵抗程度的比较

T2D组血糖水平及血浆胰岛素水平显著高于CTL组，但脑脊液胰岛素水平显著低于CTL组。T2D+S-I组大鼠血糖水平较T2D组显著降低，血浆胰岛素水平较T2D组显著增高，但脑脊液中胰岛素水平无显著变化。T2D+I-I组大鼠血糖水平及血浆胰岛素水平与T2D组比较无显著改变，但脑脊液胰岛素水平较T2D组显著增高，并与CTL组相比无显著差异。运用HOMA-IR公式评估的胰岛素抵抗程度结果显示，T2D组胰岛素抵抗程度显著高于CTL组，经胰岛素干预的2组大鼠外周胰岛素抵抗程度与T2D组比较无显著差异，表明2种胰岛素干预措施均不能改善T2D的胰岛素抵抗状态,见表2。

2免疫印迹方法检测大鼠海马内总tau蛋白和tau蛋白磷酸化水平

如图1所示，T2D组及经胰岛素干预后的T2D+S-I组和T2D+I-I组大脑海马总tau蛋白与CTL组比较无显著差异。此结果说明，外周的高胰岛素血症、高血糖症及脑脊液中的胰岛素缺乏均对总tau蛋白无影响，并且运用胰岛素干预后总tau蛋白亦无显著改变。

表2 各组大鼠的体重和实验室检查指标

*P<0.05,**P<0.01vsCTL;#P<0.05,##P<0.01vsT2D.

选择tau蛋白的磷酸化位点Ser199、Ser202及Ser396，通过检查其磷酸化程度来说明tau蛋白磷酸化水平。 如图1所示，T2D组大鼠大脑海马tau蛋白在以上3个位点均呈过度磷酸化表现，在Ser199和Ser202这2个位点的非磷酸化水平较CTL组显著下降； T2D+S-I组tau蛋白在Ser199/202位点上磷酸化程度较T2D组有减轻，但不显著，这2个位点的非磷酸化水平与T2D组相比无显著差异,而Ser396位点的磷酸化水平较T2D组明显减低；运用鼻腔滴入胰岛素干预后tau蛋白在Ser199/202及Ser396位点上过度磷酸化程度较T2D组显著减轻,Ser199/202位点的非磷酸化水平较T2D组显著升高。

Figure 1. Western blotting analysis of total tau level and phosphorylation of tau.Mean±SD.*P<0.05vsCTL;#P<0.05vsT2D.

图1免疫印迹技术检测大鼠大脑海马总tau蛋白及tau蛋白部分位点的磷酸化水平

3免疫印迹方法检测大鼠大脑海马内胰岛素信号途径中PI3K/Akt/GSK-3β的活性

胰岛素信号转导途径中PI3K活性通过其下游Akt活性来评估，当磷酸化Akt/总Akt比例越高，则Akt活性越高,即表示PI3K活性越高；而GSK-3β位于PI3K/Akt下游，其活性受Akt抑制，本研究选取磷酸化GSK-3β(Ser9)与总GSK-3β的比值来评估GSK-3β活性，比值越大，则GSK-3β活性越低。

如图2所示，各组总Akt水平无显著异常，T2D组大鼠大脑海马磷酸化Akt水平下降，T2D+S-I组中Akt磷酸化程度与T2D比较无显著改变，但T2D+S-I组Akt的磷酸化程度有上升；各组总GSK-3β水平无显著改变，T2D组大鼠大脑海马磷酸化GSK-3β水平下降，T2D+S-I组及T2D+I-I组GSK-3β的磷酸化程度均有所有上升，其中，T2D+I-I组GSK-3β磷酸化程度较T2D组上升更明显。

讨 论

Tau蛋白过度磷酸化形成的神经纤维缠结是AD最早出现的病理生理改变之一，其出现要远早于AD的临床症状出现，因此被称为AD样改变。Tau蛋白上大部分位点的过度磷酸化改变均与GSK-3β活性有关，GSK-3β活性增高可导致tau蛋白上大多数位点的过度磷酸化改变[11, 15-17]；除此之外，GSK-3β位于胰岛素信号转导途径中，当胰岛素抵抗形成或胰岛素绝对缺乏，胰岛素信号转导途径下降，位于PI3K下游的GSK-3β活性上升[11]。

前期研究证实，2型糖尿病大鼠大脑胰岛素缺乏，导致大脑胰岛素信号途径下调，位于胰岛素信号途径中位于PI3K/Akt下游的G3K-3β活性升高，最终导致海马组织tau蛋白出现AD样病变。Lee等[18]的研究显示，在对高分化海马神经细胞的培养基中加入胰岛素，可导致Aβ沉积下降；对AD小鼠海马定位注射胰岛素，可显著改善其认知功能。这些研究资料提示，AD大脑中由于低胰岛素水平导致的AD样病变可以通过注射胰岛素得到改善。有研究显示，外周胰岛素无法自由通过血脑屏障，但鼻腔滴入胰岛素可直接增加脑脊液胰岛素水平[19]。因此，本研究采用2种方法改善大脑胰岛素缺乏状态，旨在恢复大脑胰岛素信号途径，降低AD病变的发生。结果显示，运用外周胰岛素注射，可降低血浆血糖，但对血浆胰岛素水平、脑脊液胰岛素无影响，tau蛋白的过度磷酸化无显著改变；运用鼻腔滴入胰岛素后对血浆血糖、血浆胰岛素无显著影响，但增高了大脑胰岛素水平，tau蛋白过度磷酸化状态得到改善。

Figure 2. Western blotting analysis of Akt, GSK-3β and their phosphorylation.Mean±SD.*P<0.05vsCTL;#P<0.05vsT2D.

图2免疫印迹方法检测大脑胰岛素信号途径中Akt及GSK-3β活性

为了进一步探讨鼻腔滴入胰岛素治疗对tau蛋白磷酸化状态影响的机制，本研究检测了大脑胰岛素转导途径中关键酶PI3K/Akt及下游GSK-3β活性，结果表明，鼻腔滴入胰岛素导致大脑胰岛素水平增高后，可显著改善胰岛素信号转导途径，表现为PI3K/Akt活性增高，其下游的GSK-3β活性受抑，tau蛋白过度磷酸化逆转，从而改善大脑AD样改变。

综上所述，本研究发现T2D大鼠大脑呈AD样改变，与大鼠大脑内胰岛素水平降低、胰岛素信号转导途径关键酶活性下调密切相关。外周给予T2D大鼠胰岛素注射不能直接通过血脑屏障进入大脑，因此不能升高大脑胰岛素水平，tau蛋白AD样病变改善不明显，但鼻腔滴入胰岛素可直接升高脑脊液胰岛素水平，胰岛素信号转导途径恢复，AD样病变可得到改善。本研究为T2D导致 AD发病的原因提供理论依据，并为T2D时降低AD的发病风险提供治疗途径依据。

[1] Stranahan AM,Mattson MP. Metabolic reserve as a determinant of cognitive aging[J]. J Alzheimers Dis, 2012, 30(Suppl 2): S5-S13.

[2] Ott A, Stolk RP, van Harskamp F, et al. Diabetes mellitus and the risk of dementia: the Rotterdam Study[J]. Neurology, 1999, 53(9): 1937-1942.

[3] Schrijvers EM, Witteman JC, Sijbrands EJ, et al. Insulin metabolism and the risk of Alzheimer disease: the Rotterdam Study[J]. Neurology, 2010, 75(22): 1982-1987.

[4] Iqbal K, Liu F, Gong CX, et al. Tau in Alzheimer disease and related tauopathies[J]. Curr Alzheimer Res, 2010, 7(8): 656-664.

[5] Kim B, Backus C, Oh S, et al. Increased tau phosphorylation and cleavage in mouse models of type 1 and type 2 diabetes[J]. Endocrinology, 2009, 150(12): 5294-5301.

[6] Liu Y, Liu F, Grundke-Iqbal I, et al. Brain glucose transporters,O-GlcNAcylation and phosphorylation of tau in diabetes and Alzheimer’s disease[J]. J Neurochem, 2009, 111(1): 242-249.

[7] Qu Z, Jiao Z, Sun X, et al. Effects of streptozotocin-induced diabetes on tau phosphorylation in the rat brain[J]. Brain Res, 2011, 1383: 300-306.

[8] 杨 雁，胡蜀红，张建华，等. 肥胖及2型糖尿病大鼠Alzheimer病样Tau蛋白过度磷酸化修饰及机制探讨[J].生物化学与生物物理进展，2006，33(5):458-464.

[9] McNay EC,Recknagel AK. Brain insulin signaling: a key component of cognitive processes and a potential basis for cognitive impairment in type 2 diabetes[J]. Neurobiol Learn Mem, 2011, 96(3): 432-442.

[10]Holscher C. Diabetes as a risk factor for Alzheimer’s disease: insulin signalling impairment in the brain as an alternative model of Alzheimer’s disease[J]. Biochem Soc Trans, 2011, 39(4): 891-897.

[11]Jolivalt CG, Lee CA, Beiswenger KK, et al. Defective insulin signaling pathway and increased glycogen synthase kinase-3 activity in the brain of diabetic mice: parallels with Alzheimer’s disease and correction by insulin[J]. J Neurosci Res, 2008, 86(15): 3265-3274.

[12]杨 雁，王玉萍，谢君辉，等. 大脑胰岛素信号途径受损导致2型糖尿病时阿尔茨海默病发病风险增高[J].中国生物化学与分子生物学报，2012，28(5):449-454.

[13]Dhuria SV, Hanson LR, Frey WH 2nd. Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations[J]. J Pharm Sci, 2010, 99(4): 1654-1673.

[14]Hoistad M, Samskog J, Jacobsen KX, et al. Detection of β-endorphin in the cerebrospinal fluid after intrastriatal microinjection into the rat brain[J]. Brain Res, 2005, 1041(2): 167-180.

[15]Gong CX, Liu F, Grundke-Iqbal I, et al. Post-translational modifications of tau protein in Alzheimer’s disease[J]. J Neural Transm, 2005, 112(6): 813-838.

[16]魏 伟，陆大祥，戚仁斌. 叶酸和维生素B12减轻高同型半胱氨酸血症诱导的老年大鼠阿尔茨海默样病变[J].中国病理生理杂志,2012,28(8):1436-1440.

[17]徐柯乐，陈 勤，刘 伟,等.远志皂苷减轻Aβ1-40诱导的AD大鼠脑神经元tau蛋白Ser396位点的过度磷酸化[J].中国病理生理杂志,2012,28(9):1605-1609.

[18]Lee HK, Kumar P, Fu Q, et al. The insulin/Akt signaling pathway is targeted by intracellular β-amyloid[J]. Mol Biol Cell, 2009, 20(5): 1533-1544.

[19]Reger MA, Watson GS, Green PS, et al. Intranasal insulin improves cognition and modulates β-amyloid in early AD[J]. Neurology, 2008, 70(6): 440-448.

IntranasalinsulintreatmentamelioratesAlzheimerdisease-likechangesinhippocampusinaratmodeloftype2diabetes

YANG Yan, MA De-lin, WANG Yu-ping, JIANG Teng, HU Shu-hong, YU Xue-feng

(DepartmentofEndocrinology,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China.E-mail:xfyu188@163.com)

AIM: To investigate Alzheimer disease (AD)-like changes and 2 key components of the insulin signaling pathway in the brain of a rat model of type 2 diabetes (T2D) after insulin treatment.METHODSThe rat model of T2D was established by feeding a high-protein, high-glucose and high-fat diet followed by intrasubcutaneous injection of streptozocin. Intranasal insulin treatment (T2D+I-I) and subcutaneous insulin injection (T2D+S-I) were applied to elevate the insulin level in the brain. The insulin levels in plasma and cerebrospinal fluid as well as the concentration of plasma glucose were measured. Total tau level, the phosphorylation level of tau at some phosphorylation sites, and the activation of GSK-3β and Akt in subcutaneous of the rats were also analyzed by Western blotting.RESULTSAD-like changes, decreased Akt activation and over-activation of GSK-3β in the hippocampus of the T2D rats were observed. Intranasal insulin treatment for 4 weeks normalized the levels of Akt and GSK-3β, as well as reduced the AD-like changes in the hippocampus of the T2D rats, whereas the treatment with insulin by subcutaneous injection for 4 weeks had minimal effects on the levels of GSK-3β and tau phosphorylation in the hippocampus.CONCLUSIONIntranasal insulin treatment, but not subcutaneous insulin treatment, might decrease the risk of AD in T2D rats by reducing AD-like changes and up-regulating the impaired insulin signaling pathway in the hippocampus,indicating the potential use of intranasal insulin delivery for treatment of AD.

Alzheimer disease; Type 2 diabetes; Insulin; Tau hyperphosphorylation; Insulin signaling pathway

R587.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2013.01.009

1000- 4718(2013)01- 0056- 06

2012- 06- 25

2012- 11- 19

国家自然科学基金青年基金资助项目(No.81100582)；教育部博士点新教师基金资助项目(No.200804871047)；湖北省卫生厅一般项目(No.JX5B04)

△通讯作者 Tel： 027-83662883；E-mail： xfyu188@163.com