软脉降脂合剂干预动脉搭桥术内皮细胞损伤的研究*

许 平， 彭 辉， 朱 莹， 贺嵩敏， 冯 兵， 李秀丽， 黄小千， 陈 婷， 张小宁， 郑广娟△

(1广东省心血管病研究所, 2广东省人民医院，广东 广州 510080； 3 广东省中医院, 4广东省中医药科学院，广东 广州 510006；5山东中医药大学，山东 济南 250355； 6广州中医药大学，广东 广州 510006； 7安徽省立友谊医院，安徽 合肥 230041)

软脉降脂合剂干预动脉搭桥术内皮细胞损伤的研究*

许 平1,2， 彭 辉3,4， 朱 莹3,4， 贺嵩敏3,4， 冯 兵3,4， 李秀丽5， 黄小千5， 陈 婷6， 张小宁7， 郑广娟3,4△

(1广东省心血管病研究所,2广东省人民医院，广东 广州 510080；3广东省中医院,4广东省中医药科学院，广东 广州 510006；5山东中医药大学，山东 济南 250355；6广州中医药大学，广东 广州 510006；7安徽省立友谊医院，安徽 合肥 230041)

目的观察软脉降脂合剂对兔动脉搭桥术后内皮细胞功能的影响，探讨软脉降脂合剂在动脉搭桥术后再狭窄发生过程中的防治作用，以及中药治疗冠状动脉搭桥术(CABG)后再狭窄的可能作用机制。方法新西兰大白兔随机分为4组：模型组、阿司匹林对照组、软脉降脂中剂量组和软脉降脂高剂量组，行右侧颈动脉搭桥术。术后给药灌胃8周后，取抗凝血用流式细胞仪检测循环内皮细胞(CECs)，取血清用ELISA检测P-选择素和细胞间黏附分子1(ICAM-1)水平。结果各给药组和模型组比较，CECs相对比例、P-选择素和ICAM-1明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。软脉降脂合剂2组与阿司匹林对照组比较差异也有统计学意义(P<0.05)。结论中药软脉降脂合剂能够降低动脉搭桥术后的CECs、P-选择素和ICAM-1水平，有助于改善CABG术后内皮细胞的功能。

软脉降脂合剂； 动脉搭桥术； 内皮细胞

动脉粥样硬化是当今世界威胁人类健康、导致人群发病和死亡的主要疾病之一。冠状动脉搭桥术(coronary artery bypass grafting，CABG)是晚期冠心病患者主要的治疗方法。术后10年，约有50%静脉桥血管出现严重狭窄[1]，而内皮细胞的损伤是静脉桥病变的始动因素和主要原因[2]。本研究旨在观察中药复方软脉降脂合剂对兔动脉搭桥术后内皮功能的影响，从而为CABG预后的改善提供实验依据。

材 料 和 方 法

1材料

1.1试剂和仪器 FITC标记CD146抗体(eBioscience)；小鼠抗兔CD45抗体(AbD Serotec MCA808GA)；PE标记山羊抗小鼠IgG(Santa Cruz)；兔可溶性P-选择素(soluble P-selectin,sP-selectin) 酶联免疫分析试剂盒(Cusabio)；兔细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1/CD54)酶联免疫分析试剂盒(Cusabio)。软脉降脂合剂，由山东中医药大学药厂提供，产品批号：20l20601；阿司匹林肠溶片购自拜耳医药保健有限公司,产品批号：BJ06370。Eppendorf高速台式冷冻离心机，型号为5430R；贝克曼库尔特公司产流式细胞仪，型号为FC500；WPI双目动物手术显微镜，型号为PSMT5。

1.2动物 新西兰大白兔32只，雌、雄不限，体重2.0～2.5 kg，由广州市花都区花东信华实验动物养殖场提供，动物实验许可证号为SYXK(粤)2008-0094，动物质量合格证号为0104377。

2方法

2.1动脉搭桥术动物模型建立 按文献[3-4]建立动物模型。兔称取体重后，按1 mL/kg腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉，给予2 500 U肝素抗凝。外科无菌操作技术下，取右侧颈静脉约2 cm作为自体血管桥备用，断端用8/0号线缝合。分离暴露右侧颈动脉，在手术显微镜下以10/0 prolene线将截取的颈静脉与该段颈动脉行端侧吻合。镜下观察吻合端血流通畅，无漏血渗血。遂切口分层缝合，创面滴青霉素数滴以防感染。术后常规给予青霉素肌注3d以预防感染。手术后至处死前均给予肝素2 500 U/d。手术过程中死亡1只，考虑该只动物手术时间过长，循环衰竭死亡。

2.2分组及给药 32只新西兰大白兔，随机分为4组：模型组、阿司匹林对照组、软脉降脂中剂量组、软脉降脂高剂量组，每组8只。行右侧颈总动脉搭桥术后，各组均饲以正常饮食，模型组给予生理盐水10 mL/d灌胃，阿司匹林对照组给予阿司匹林每只2.2 mg/d灌胃，软脉中、高剂量组分别给予每只0.11 g/d、0.22 g/d灌胃。给药时间为8周。灌胃过程中模型组死亡2只，解剖发现吻合段血管栓塞，且感染严重，考虑术后并发症死亡。

3指标检测

3.1流式细胞术检测循环内皮细胞(circulating endothelial cells，CECs)比例 以含 EDTA-K2抗凝的血常规管采血2 mL，血液采集后2 h内处理。取2支流式管，其中第1管加入5 μL CD146-FITC，检测单种CD146标记的CECs；第2管先加入5 μL CD146-FITC，然后每管加入EDTA-K2 抗凝的全血50 μL。洗脱后第2管再加入共同孵育过的5 μL CD45和5 μL IgG-PE，检测2种标记的CECs。混匀后室温下避光孵育20 min ，加入10 mL 溶血素，37 ℃水浴箱内放置10 min，待完全溶血后，立刻上流式细胞仪检测。

3.2ELISA检测P-选择素表达 分离胶促凝采血管取血，离心后取血清。酶联板标准孔中加入相应标准品50 μL，检测孔分别加入已稀释血清50 μL，并立即加入酶结合物工作液50 μL，轻轻晃动混匀。37 ℃反应30 min。洗板5次，每次浸泡1～2 min，200 μL/well，甩干。依序每孔加底物溶液90 μL，37 ℃避光显色10 min。依序每孔加终止溶液50 μL，终止反应。15 min内用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的吸光度(A)。用专业软件Curve Exert 1.3制作标准曲线，根据标准曲线的直线回归方程式计算出样品浓度。

3.3ELISA检测ICAM-1表达 分离胶促凝采血管取血，离心后取血清。酶联板空白孔中加样品稀释液100 μL，余孔分别加标准品或待测样品100 μL，轻轻晃动混匀。37 ℃反应120 min。弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液100 μL，37 ℃，60 min。温育60 min后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1～2 min，200 μL/well，甩干。依序每孔加底物溶液90 μL，37 ℃避光显色5 min。依序每孔加终止溶液50 μL，终止反应。15 min内用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的A值。用专业软件Curve Exert 1.3制作标准曲线，根据标准曲线的直线回归方程式计算出样品浓度。

4统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，多组之间比较采用方差分析。

结 果

1CECs检测结果

单标CD146+CECs绝对计数及相对比例分析，各给药组与模型组比较均减低，差异有统计学意义(P<0.05)，软脉降脂合剂中、高剂量2组与阿司匹林对照组比较也有降低，差异有统计学意义(P<0.05)；双标CD146+/CD45-CECs绝对计数及相对比例分析，各给药组与模型组比较均降低，差异有统计学意义(P<0.05)，软脉降脂合剂高剂量组与阿司匹林对照组比较也有降低，差异有统计学意义(P<0.05)；软脉降脂合剂2组组间未见显著差异，但是表现出一定的量效正相关,见图1。

Figure 1. The comparison of the absolute number and relative proportion of CECs detected by two methods. A: absolute number of CD146+CECs; B: relative proportion of CD146+CECs; C: absolute number of CD146+/CD45-CECs; D: relative proportion of CD146+/CD45-CECs.Mean±SD.n=6 in model group;n=8 in other groups.*P<0.05vsmodel group;▲P<0.05vsaspirin group.

图12种方法标记CECs的绝对数量和相对比例比较

2P-选择素ELISA检测结果

软脉降脂合剂中、高剂量组和阿司匹林对照组P-选择素含量与模型组相比均降低，差异有统计学意义(P<0.05)，软脉降脂合剂高剂量组与阿司匹林对照组比较也有降低，差异有统计学意义(P<0.05),见图2。

3ICAM-1ELISA检测结果

软脉降脂合剂中、高剂量组和阿司匹林对照组ICAM-1水平与模型组相比均降低，差异有统计学意义(P<0.05)，软脉降脂合剂中、高剂量组ICAM-1水平与阿司匹林对照组比较也有降低，差异有统计学意义(P<0.05),见图3。

讨 论

CABG术后再狭窄是一个复杂的生物学过程，血管内皮细胞(vascular endothelial cells，VECs)损伤是导致术后再狭窄的关键因素。CECs是指外周血中测得的血管内皮细胞。目前的研究表明，CECs数量可以表明血管损伤的程度或和其相关，而且CECs的决定因素比较单一。外周血中增多的循环内皮细胞有效反映血管的损伤和机能障碍。因此，CECs可以作为检测抗血管损伤治疗药物疗效的标志物之一，在血管损伤治疗中具有很大的研究前景[5]。由于现在对定义CECs的最好CD分子组合缺乏统一性，并且兔的抗体不易获得，我们选择了最被大家广泛应用的CD146和CD45。通过CD45-来排除造血细胞及活化的T淋巴细胞。CD146是重要的标志物，虽然CD146在滋养母细胞、骨髓成纤维细胞、周细胞和一些肿瘤细胞上都有表达，但是它是能从CD45-细胞群中分辨出CECs的特异性标志物。

Figure 2. Concentration of P-selectin detected by ELISA.Mean±SD.n=6 in model group;n=8 in other groups.*P<0.05vsmodel group;▲P<0.05vsaspirin group.

图2P-选择素ELISA检测结果分析

Figure 3. Concentration of ICAM-1 measured by ELISA.Mean±SD.n=6 in model group;n=8 in other groups*P<0.05vsmodel group；▲P<0.05vsaspirin group.

图3ICAM-1ELISA检测结果分析

随着对再狭窄分子机制的深入研究，人们发现参与再狭窄过程中的多种粘附分子都参与其中。P-选择素是细胞粘附分子中的选择素家族的主要成员之一。血管受损后，P-选择素暴露于血小板质膜表面，通过与单核细胞、中性粒细胞和T淋巴细胞表面的配体结合，在血小板和白细胞相互作用的过程中，启动血栓形成的凝血反应[6]，并且导致血管内膜的增生[7]。从而，在与CABG术后再狭窄的炎症反应和血栓形成中起重要作用。

ICAM-1是细胞表面上的一种跨膜蛋白抗原，在CABG中，不仅造成白细胞浸润、活化、炎症因子释放，加剧了组织的损伤，而且导致损伤的组织修复延滞；同时位于白细胞表面的粘附分子——β2整合素，即血管内皮细胞表面的ICAM-1(CD54)介导的级联反应可以进一步增强白细胞的上述变化以及淋巴细胞的活化。有研究显示，通心络超微粉可能通过抗氧化、抑制NF-κB核转位进而降低ICAM-1蛋白表达保护血管内皮功能，有效阻止动脉粥样硬化的进展[8]。ICAM-1升高的程度直接反映内皮细胞表达 ICAM-1 的状况，因此，血浆中的ICAM-1可作为一种潜在内皮功能状态的标志[9]。

活血化瘀中药干预心血管疾病已得到众多研究肯定，有报道蜂胶水提物通过对血管内皮细胞粘附分子表达的影响起到抗动脉粥样硬化的作用[10]。根据中医药理论及CABG术后VECs损伤的病理生理机制的新的观点，我们提出益气活血降浊软坚中药配伍有望提高干预CABG术后VECs损伤的疗效,进而提出了益气活血降浊软坚中药组方的复方：软脉降脂合剂，并且对其降脂及改善内皮功能进行了预试验，包括基础实验研究[11]及临床研究[12]。软脉降脂合剂是由黄芪、丹参、决明子及昆布的提取物等组成，其功能主要是益气健脾、化痰降浊和活血通络。

实验中我们采用了单标CD146+计数CECs法及双标CD146+/CD45-计数CECs法，比较了实验兔模型组与给药组CECs占全血细胞数量的百分比情况。结果发现模型组和给药组比较，无论在单标CD146计数CECs法还是在2种标志物计数CECs法中，平均CECs的百分比均是明显增高，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。中药与西药对照组比较差异也有统计学意义(P<0.05)。而软脉降脂合剂中、高两个剂量组虽然组间比较未见有显著差异，但是还是表现出了一定的量效关系。ELISA检测P-选择素和ICAM-1的表达，软脉降脂合剂中、高剂量组和西药对照组与模型组相比均降低，差异有统计学意义(P<0.05)，软脉降脂合剂高剂量组与西药对照组比较也有降低，差异有统计学意义(P<0.05)。本研究发现，在CABG术后，P-选择素和ICAM-1的表达主要在手术段血管内皮细胞升高，软脉降脂合剂能够明显抑制损伤血管内膜P-选择素和ICAM-1的表达，同时降低CECs数量，从而减轻术后内皮细胞的损伤。综上可见，中药软脉降脂合剂对于CABG术后的血管内皮损伤有促进修复的作用，有助于改善CABG的预后。

[1] Goldman S，Zadina K，Moritz T，et al．Long-term patency of saphenous vein and left internal mammary artery grafts after coronary artery bypass surgery： results from a Department of Veterans Affairs cooperative Study[J]．J Am Coll Cardiol，2004，44(11)：2149-2156．

[2] Fang L，Wei H，Mak KH，et al．Markers of low-grade inflammation and soluble cell adhesion molecules in Chinese patients with coronary artery disease[J]．Can J Cardiol，2004，20(14)：1433-1438．

[3] Shi Y, O’Brien JE, Mannion JD, et al. Remodeling of autologous saphenous vein grafts: the role of perivascular myofibroblasts[J]. Circulation,1997,95(12): 2684-2693.

[4] O’Brien JE, Shi Y, Fard A, et al. Wound healing around and within saphenous vein bypass grafts[J]. J Thorac Cardiovasc Surg,1997,114(1):38-45.

[5] Woywodt A, Bahlmann FH, De Groot K, et al. Circulating endothelial cells: life, death, detachment and repair of the endothelial cell layer[J]. Nephrol Dial Transplant, 2002, 17(10):1728-1730.

[6] Yasue H，Nakagawa H，Itoh T，et al．Coronary artery spasm: clinical features，diagnosis，pathogenesis，and treatment[J]．J Cardiol, 2008, 51(1): 2-17．

[7] Li M, Zhang Y, Ren H, et al． Effect of elopidogrel on the inflammatory progression of early atherosclerosis in rabbits model [J]．Atheroselerosis, 2007, 194(2): 348-356.

[8] 吴以岭, 袁国强, 游佳华, 等. 通心络超微粉对高脂饮食兔主动脉内皮保护机制的实验研究[J]. 中国病理生理杂志, 2007, 23(4): 629-633.

[9] Suboda V, Todd JA. Fundamental of endothelial function for the clinical cardiologist[J]．Circulation, 2002, 105(5): 546-549．

[10]张云香, 陈文峰, 王家富, 等. 蜂胶水提物对血管内皮细胞黏附分子表达的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2010, 26(12): 2311-2315.

[11]马慧萍, 郑广娟, 张 静, 等. 软脉降脂胶囊对载脂蛋白 E基因敲除小鼠动脉粥样硬化影响的实验研究[J]. 中西医结合心脑血管病杂志, 2005, 3(2): 132-134.

[12]李宝华, 郑广娟, 张文高, 等. 自制软脉降脂胶囊对血脂及内皮依赖性舒张功能的影响[J]. 实用医药杂志, 2004, 21(9): 820-821.

EffectofRuanmaijiangzhimixtureinterventiononendothelialcellfunctionafterarterybypassgraft

XU Ping1,2, PENG Hui3, 4, ZHU Ying3, 4, HE Song-min3, 4, FENG Bing3, 4, LI Xiu-li5, HUANG Xiao-qian5, CHEN Ting6, ZHANG Xiao-ning7, ZHENG Guang-juan3,4

(1GuangdongCardiovascularInstitute,2GuangdongGeneralHospital,Guangzhou510080,China;3GuangdongHospitalofTraditionalChineseMedicine,4GuangdongProvincialAcademyofChineseMedicalSciences,Guangzhou510006,China;5ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355,China;6GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510006,China;7AnhuiProvincialFriendshipHospital,Hefei230041,China.E-mail:zhengguangjuan@163.com)

AIM: To observe the effect of Ruanmaijiangzhi mixture on the function of endothelial cells in rabbits after artery bypass graft.METHODSA New Zealand white rabbit model of right common carotid artery bypass graft was established. The rabbits were randomly divided into 4 groups: model group, aspirin control group, middle dose of Ruanmaijiangzhi group and high dose of Ruanmaijiangzhi group. Eight weeks after treatment, circulating endothelial cells (CECs) in anticoagulated blood were detected by flow cytometry. The serum levels of P-selectin and intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) were measured by ELISA.RESULTSCompared with model group, the relative ratio of CECs, and the levels of P-selectin and ICAM-1 in medication administration groups were significantly decreased. The effect in Ruanmaijiangzhi groups was better than that in aspirin control group. Ruanmaijiangzhi treatment showed a positive dose-related correlation.CONCLUSIONChinese medicine Ruanmaijiangzhi mixture decreases CECs, P-selectin and ICAM-1 to improve the endothelial cell function after coronary artery bypass graft.

Ruanmaijiangzhi mixture; Artery bypass graft; Endothelial cells

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.01.003

1000- 4718(2013)01- 0015- 05

2012- 11- 01

2012- 12- 20

广东省自然科学基金资助项目(No.9151009504000007)；高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(No.20104425110005)

△通讯作者 Tel：020-81887233；E-mail：zhengguangjuan@163.com.