高效液相色谱法测定鸡饲料中噁喹酸的含量

中国农业大学动物医学院 吴 超 程林丽 张素霞 董晓云

北京市顺义区动物卫生监督所 李林霞

1 材料与方法

1.1 实验仪器 高效液相色谱仪Waters 2996-Photodiode Array Detector（Waters 2695 Separations Module）；配荧光检测器；涡动仪（北京北德科学器材有限公司）；2K15通用台式冷冻离心机（美国 Sigma公司）；R-200旋转蒸发仪 （瑞士BUCHI公司）；天平（感量 0.01 g，德国 Accula 公司）；分析天平（感量 0.0001 g，德国 Sartorius公司）；水平摇床；移液器；一次性注射器；0.45 μm有机滤膜。

1.2 药品和试剂 除特殊注明外，本法所用试剂均为分析纯，水符合GB/T 6682中一级水的规定。喹酸标准品 （纯度 ≥99.7%，购于Sigma公司）；甲醇、乙腈均为色谱纯（购于Sigma公司）；氢氧化钠；无水硫酸钠；乙酸乙酯；正己烷；磷酸。

1.3 标准溶液的配制

1.4 液相色谱条件 色谱柱：Intel ODS-3 C18柱，50 mm×4.6 mm（i.d.），粒径 5 μm；柱温：室温；流动相：0.02 mol/L磷酸溶液－乙腈－四氢呋喃（69∶16∶15，V∶V∶V）；流速：0.8 mL/min；进样体积：20 μL；激发波长：325 nm；发射波长：369 nm。

1.5 样品前处理 称取配合饲料2 g（或浓缩饲料、预混合饲料1 g，精确到0.01 g）于50 mL离心管中，加无水硫酸钠2 g，加乙酸乙酯10 mL，300 r/min振荡30 min。经8000 r/min离心10 min后，取上清液至鸡心瓶。残渣中加入10 mL乙酸乙酯，重复提取一次，合并两次上清液。50℃旋蒸至干，加入0.02 mol/L磷酸溶液0.8 mL，涡动10 s，再加入正已烷1.6 mL，涡动1 min。将混合液转入10 mL离心管中，于3000 r/min离心10 min，取下层清液并用0.02 mol/L磷酸溶液定容至1.0 mL，过0.45 μm有机滤膜后供高效液相色谱分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制 用流动相稀释呵恶喹酸标准贮备液， 配制成浓度为 10、20、50、100、300、500 ng/mL的系列工作液，以药物浓度为横坐标，喹酸峰面积为纵坐标绘制标准曲线（图1）。喹酸的标准曲线方程为y=53.83x-139.6，相关系数为0.999。

2.2 方法的灵敏度 取10个空白样品按1.5中的方法处理后进行HPLC检测。测得基线噪音值，并求其平均值。按信噪比S/N=3为检测限（LOD），S/N=10为定量限（LOQ），结果见表1。由表1可见，鸡配合饲料、鸡浓缩饲料、鸡预混合饲料中喹酸检测限为 2.02～5.93 μg/kg，定量限为 6.72～19.74 μg/kg。因此，确定方法的检测限为 6.0 μg/kg，定量限为 20.0 μg/kg。

2.3 检测方法的准确度和精密度 对鸡配合饲料、鸡浓缩饲料、鸡预混饲料分别进行20、200、2000 μg/kg的药物空白添加回收实验，按1.5中的方法处理后进行HPLC检测。每个浓度设5个平行，连续做3 d，计算添加回收率、日内变异系数和日间变异系数，结果见表2。由表2可见，在三个浓度添加水平下，各类饲料中喹酸的平均回收率为85.75%～96.77%，均满足70%～120%；日内变异系数为2.24%～9.63%，均小于15%，日间变异系数为2.35%～8.35%，均小于15%，方法回收率高，精密度好。各类饲料的相关色谱图见图2至图8。由图可见，在鸡配合饲料、鸡浓缩饲料、鸡预混饲料中喹酸保留时间处无杂峰干扰。

表1 饲料中喹酸检测的LOD和LOQ（n=10） μg/kg

表1 饲料中喹酸检测的LOD和LOQ（n=10） μg/kg

饲料种类 LOD LOQ鸡配合饲料 4.60 15.32鸡浓缩饲料 4.14 13.80鸡预混合饲料 2.02 6.72

表2 饲料中喹酸添加回收率及变异系数

表2 饲料中喹酸添加回收率及变异系数

样品 添加浓度/（μg/kg）平均回收率/% 日内变异系数（n=5，%）日间变异系数（n=15，%）鸡配合饲料20 93.16 6.46 6.82200 92.43 5.28 6.752000 94.62 7.75 8.1710000 87.33 5.29 6.31鸡浓缩饲料20 92.73 6.82 7.14400 92.96 7.10 7.284000 94.55 5.79 6.22100000 85.75 2.24 2.35预混合饲料20 96.77 4.86 5.62200 90.56 9.63 8.3510000 94.64 7.39 7.74100000 88.95 5.06 5.18鸡

3 讨论

3.1 仪器条件的建立 刘艳萍等（2009）用0.01 mol/L 草酸-乙腈（65∶35，V∶V）分析了鳗鱼中的喹酸。李耀平等（2004）采用乙腈-水（用冰乙酸调pH3.0，60∶40，V∶V∶V） 分析了出口欧鳗中的喹酸。仲锋等（2002）以及农业部236号公告中均采用0.02 moL/L磷酸溶液-乙腈-四氢呋喃 （69∶16∶15，V∶V∶V）分离检测了鱼肉组织或动物样品组织中的喹酸和氟甲喹。钱疆等（2002）年用甲醇-乙腈-5 mmol磷酸二氢钠 （用20%磷酸调pH=3）分析出口水产品中的喹酸。通过对上述文献报道的仪器分析方法进行验证，结果发现，这些流动相条件均能满足喹酸的检测需要，但采用0.02 mol/L 磷酸溶液-乙腈-四氢呋喃 （69∶16∶15，V∶V∶V）流动相分析时喹酸峰形最佳，出峰时间最合适，因此采用该流动相组成。

3.2 样品前处理 在样品的提取净化中，分别采用乙酸乙酯、磷酸盐缓冲液、乙腈试剂进行研究，结果表明，乙酯乙酯提取的药物回收率在95%以上且共提取物较少；磷酸盐缓冲液提取，共提取杂质多且去蛋白不彻底；乙腈提取共提取物虽少，但回收率仅70%左右。因此选择乙酸乙酯作为样品提取液。用乙酯乙酯提取饲料中的喹酸后，通过旋转蒸发和磷酸缓冲液复溶来转换溶剂，然后经正已烷去脂净化后分析。整个样品前处理过程未使用价格昂贵的固相萃取小柱，节省了分析成本，且整个提取过程步骤简单，易于操作。

4 结论

[1]刘艳萍，冷凯良，王清印，等.高效液相色谱法测定鳗鱼中氟甲喹和喹酸的残留量[J].上海海洋大学学报，2009，18（3）：332 ～ 337.

[2]李耀平，李寿崧，吴文忠，等.出口欧鳗中喹酸残留痕量检测新技术研究[J].检验检疫科学，2004，14（2）：37 ～ 39.

[3]钱疆，李耀平，李寿崧.出口养殖水产品喹酸残留的HPLC监控、验证检测[J].福建分析测试，2002，11（3）：1606 ～ 1609.

[5]Harry V B.Analysis of oxolinic acid in fish by high—performance liquid chromatography[J].Journal of Chromatography，1990，530：75 ～ 82.