α7nAChR的激活通过抑制TNF-α表达促进糖尿病小鼠伤口愈合*

范琰琰， 叶光华， 林刻智， 董缪武， 冯相平， 韩军鸽， 李兴彪， 喻林升

(温州医学院基础医学院法医学教研室，浙江 温州 325035)

α7nAChR的激活通过抑制TNF-α表达促进糖尿病小鼠伤口愈合*

范琰琰△， 叶光华， 林刻智， 董缪武， 冯相平， 韩军鸽， 李兴彪， 喻林升

(温州医学院基础医学院法医学教研室，浙江 温州 325035)

目的观察糖尿病小鼠伤口愈合期间巨噬细胞浸润及肿瘤坏死因子 α(TNF-α)表达特征，探讨α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAChR)特异性激动剂PNU-282987是否可通过抑制TNF-α表达促进糖尿病小鼠伤口的愈合。方法(1) 制作糖尿病小鼠切创模型(糖尿病组)，正常小鼠在相同部位制作相同大小创口作为对照(对照组)，分别于切创后1 d、3 d、5 d、10 d、14 d和21 d(每个时间段5只)提取创口样本。免疫组化观察创口中巨噬细胞和成纤维细胞数量，Western blotting检测TNF-α表达水平，Masson染色观察胶原沉积情况。 (2) 在糖尿病小鼠切创后，选择合适的干预时间窗进行PNU-282987干预，然后观察上述指标变化。结果(1) 与对照组相比，糖尿病组创口愈合明显延迟，在切创初期的伤口中巨噬细胞数量和TNF-α表达水平较低(P<0.05)，而切创5 d后的伤口巨噬细胞数量和TNF-α表达水平显著增加(P<0.05)，成纤维细胞数量和胶原含量减少(P<0.05)。 (2) 在切创5 d后对糖尿病小鼠腹腔注射PNU-282987，可显著减少伤口中TNF-α表达，提高成纤维细胞数量和胶原含量，促进伤口愈合。结论糖尿病伤口愈合具有炎症反应发生迟但不易消退的特征。在炎症反应明显期激活α7nAChR可抑制TNF-α表达，促进糖尿病小鼠的伤口愈合。

糖尿病； 创面愈合； α7烟碱型乙酰胆碱受体； 肿瘤坏死因子α

糖尿病是严重威胁人类健康的代谢性疾病，据统计当前全世界有2.85 亿糖尿病患者, 预计到2030年全世界的糖尿病患者将达到4.39亿[1]，而伤口愈合能力受损是糖尿病患者的一个严重并发症[2], 如果创口迁延不愈, 则有可能致残。虽然目前临床上已有一些手段用来应对糖尿病患者伤口不愈，但治疗方法及疗效却十分有限[3]。因此，如何进一步阐明糖尿病患者伤口不愈的机制，逐步更新和完善对其治疗的策略已成为当今国内外研究的重点。

伤口愈合是一个多细胞、多分子参与的复杂过程, 可分为炎症、增殖和再塑3个阶段。炎症细胞浸润、成纤维细胞增殖及胶原沉积是伤口愈合中至关重要的事件。经大量研究证实，炎症反应紊乱是糖尿病伤口愈合的重要特征，迁延不愈的糖尿病伤口中常出现过量的促炎介质。肿瘤坏死因子 α (tumor necrosis factor α，TNF-α)是抑制伤口愈合的主要促炎介质之一，其主要由浸润的巨噬细胞产生，TNF-α大量释放可诱导成纤维细胞过度凋亡，抑制胶原沉积，最终延迟伤口愈合[4-7]。

我们初期的研究表明，在伤口愈合期间α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR)广泛表达于浸润的巨噬细胞[8]。据文献报道，激活α7nAChR可抑制巨噬细胞释放TNF-α，减轻局部的炎症反应[9-10]。本研究旨在：(1)建立糖尿病小鼠切创模型，观察糖尿病小鼠伤口愈合期间巨噬细胞的浸润特征及TNF-α的表达特征；(2)选择合适的干预时间窗进行α7nAChR特异性激动剂PNU-282987的干预，观察α7nAChR的激活对糖尿病伤口中TNF-α表达的影响，探讨α7nAChR对糖尿病伤口愈合的调控作用。

材 料 和 方 法

1动物

清洁级ICR小鼠，8周龄，25～30 g，由温州医学院实验动物中心提供，许可证号为SYXK(浙)2005-0061。

2主要试剂

链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)购自Sigma；大鼠抗F4/80单克隆抗体和山羊抗TNF-α多克隆抗体、兔抗热休克蛋白47(heat-shock protein 47，HSP47)多克隆抗体均购自Santa Cruz；生物素化驴抗兔IgG(H+L)和生物素化羊抗大鼠IgG(H+L)购自Abcam；小鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)单克隆抗体购自Signalchem；ECL发光试剂盒购自Santa Cruz；其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

3主要方法

3.1糖尿病小鼠切创模型制备 ICR雄性小鼠，体重25～30 g(8周龄)，清洁级，本单位动物中心提供。适应性饲养1周后，禁食12 h，腹腔注射STZ(150 mg/kg)诱导小鼠糖尿病模型，注射3 d后，小鼠禁食12 h，测定小鼠尾静脉血糖浓度，以空腹血糖浓度≥13.875 mmol/L作为糖尿病造模成功的标准。造模成功的糖尿病小鼠饲养3周后，将小鼠麻醉，剪除背部毛发，然后用活检穿孔器在其背部正中做一直径0.6 cm的圆形创口(切除皮肤全层，深达筋膜)，切创后清洁创口，进行敷料敷贴。为了让敷料不易脱落，敷贴前将安息香酊乙醇溶液均匀涂抹于距创口边缘1.5 cm处，待其干燥后，3M无菌透明生物敷料(型号1624W)敷贴创口。

3.2动物分组 (1)糖尿病组：按上述方法制作糖尿病小鼠切创模型，分别于切创后1 d、3 d、5 d、10 d、14 d和21 d(每个时间段5只小鼠)去除敷料，进行大体拍照观察，然后处死小鼠，提取创口样本；(2)对照组：正常血糖小鼠在相同部位制作相同大小的创口作为对照，分别于切创后相同时点处死小鼠，提取创口样本； (3)PNU-282987组及阴性对照组：糖尿病小鼠于切创5 d后开始腹腔注射α7nAChR特异性激动剂PNU-282987(生理盐水稀释)或等量生理盐水，分别于切创后10 d、14 d和21 d(每个时段5只小鼠)提取创口样本。根据文献报道[11]，PNU-282987的给药浓度为2.4 mg/kg。

3.3创口愈合形态学观察 (1)计算机分析数码相机所拍摄图像，按以下公式计算创面愈合率。创面愈合率(%)= (创面初始面积-创面形成后第n天的面积)/创面初始面积×100%；(2)提取创口样本，多聚甲醛固定后制作石蜡切片，采用常规HE染色，观察创口的组织形态学变化。

3.4免疫组织化学染色 切片脱蜡、水化，滴加3%过氧化氢室温孵育10 min后，微波法修复抗原。5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA) 封闭1 h，滴加大鼠抗F4/80单克隆抗体(稀释度1∶100)或兔抗HSP47多克隆抗体(稀释度1∶400)保湿盒内4 ℃孵育过夜；PBS洗涤切片，生物素标记的羊抗大鼠IgG或驴抗兔IgG保湿盒内孵育30 min；滴加SP试剂，保湿盒内孵育60 min；DAB显色后，苏木素轻度复染，脱水、透明、封片。染色过程中以PBS或非免疫血清替代Ⅰ抗作为阴性对照。显微镜(×400) 下每个标本于损伤区随机选择10 个视野，计算每个视野中阳性染色细胞数。

3.5Western blotting检测 冰浴上将各时段皮肤样本剪碎，加蛋白裂解液300 μL 及苯甲基磺酰氟匀浆，超声破碎，4 ℃、12 000 r/min 离心30 min，吸取上清液，用Lowry 法测量蛋白浓度，将样品置于-80 ℃保存，备用。变性5 min，进行10%SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白后，将蛋白转印到PVDF 膜上，转膜条件为5 V、40 min。含有吐温的Tris-HCl缓冲液(TBST) 洗涤3 次，用5%脱脂牛奶封闭2 h，用山羊抗TNF-α多克隆抗体(1∶500) 孵育，4 ℃过夜。TBST 洗涤3 次，辣根过氧化物酶标记兔抗山羊IgG (1∶10 000) 4 ℃孵育过夜，TBST 洗涤3 次后，电化学发光法(ECL) 发光。使用Scion Image软件分析各显色谱带的灰度，以GAPDH为内参照，计算切创后各时段伤口样本中TNF-α蛋白的相对表达水平。

3.6Masson染色 切片脱蜡、水化，Weigert苏木精液染核5～10 min，盐酸乙醇分化数秒，丽春红酸性复红液浸染5～10 min，2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，1%磷钼酸水溶液分化3～5 min，苯胺蓝浸染5 min。0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，脱水、透明、封片。显微镜(×400) 下每个标本于损伤区随机选择10 个视野，应用Image-Pro Plus 6.0 图像分析系统测定胶原容积分数(胶原容积分数=视野中胶原面积/视野创口总面积)。

4统计学处理

用SPSS 16.0统计软件进行分析。数据用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1创口愈合形态学观察

1.1创面愈合率 糖尿病组与对照组相比，创面愈合明显延迟；从切创后第3 d，两组的创面愈合率即出现明显差异(5.21%vs32.63%)；至切创后第21 d，糖尿病组小鼠创面均未愈合，而对照组小鼠创面均已完全愈合。与糖尿病组相比，PNU-282987组在切创后10 d、14 d和21 d的创面愈合率显著增加(分别为40.16%vs78.95%、61.86%vs93.12%和79.89%vs100%)，见图1。

Figure 1. Percentage of wound healing at different posttraumatic time points (scale bar=2 mm). Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsdiabetes.

图1切创后各时点的伤口愈合率

1.2组织形态学观察 (1)对照组：切创后1～3 d，伤口可见大量炎症细胞浸润；伤后3 d成纤维样细胞开始出现在伤口底部，于伤后5 d 显著增多，伤后14 d达到峰值；伤后5～10 d，伤口内还可见大量的新生血管，与成纤维样细胞、炎症细胞共同形成肉芽组织；伤后14～21 d，损伤区新生血管显著减少，间质增多，肉芽组织向瘢痕组织转变；(2)糖尿病组：切创后1～3 d，伤口可见炎症细胞浸润，于伤后5 d 显著增多，伤后10 d达到峰值，至伤后14 d仍可见大量炎症细胞浸润；伤后10～21 d，肉芽组织形成，其内可见散在分布的成纤维样细胞和新生血管；(3)PNU-282987组：糖尿病小鼠切创5 d后开始腹腔注射α7nAChR特异性激动剂PNU-282987，伤后10～14 d，肉芽组织形成，其内可见大量的成纤维样细胞和新生血管；伤后21 d，损伤区间质增多，肉芽组织向瘢痕组织转变，见图2。

Figure 2. Histological examination at different posttraumatic time points (HE staining,×400, scale bar=20 μm).

图2切创后各时点的组织形态学观察

2切创后巨噬细胞的浸润特征及TNF-α的表达特征

2.1巨噬细胞浸润特征 F4/80(巨噬细胞标记物)的免疫组织化学染色显示，与对照组相比，糖尿病组小鼠切创后1～3 d巨噬细胞浸润显著减少(P<0.05)，切创后5～14 d创口中巨噬细胞数量显著增多(P<0.05)，见图3A。

Figure 3. The number of macrophages and the expression of TNF-α at each posttraumatic time point. A: immunohistochemical staining of F4/80 (macrophage marker) in wound samples at 10 d after injury (×400, scale bar=10 μm) and the number of macrophages at each posttraumatic time point; B: the expression of TNF-α at each posttraumatic time point. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol.

图3切创后各时点巨噬细胞数量及TNF-α的表达情况

2.2TNF-α表达特征 Western blotting检测显示，与对照组相比，糖尿病组小鼠切创后1～3 d创口中TNF-α的表达显著减少(P<0.05)，切创后5～14 d创口中TNF-α的表达显著增多(P<0.05)，见图3B；而在切创5 d后对糖尿病小鼠腹腔注射PNU-282987可显著下调切创后10 d、14 d和21 d创口中TNF-α的蛋白表达水平(P<0.05)，见图4。

3创口中的成纤维细胞数量和胶原含量

HSP47(成纤维细胞标记物)的免疫组织化学染色及Masson染色显示，糖尿病组小鼠切创5 d后伤口成纤维细胞数量和胶原含量显著低于对照组(P<0.05)；而在切创5 d后对糖尿病小鼠腹腔注射PNU-282987可显著上调切创后10 d、14 d和21 d创口中的成纤维细胞数量和胶原含量(P<0.05)，见图5、6。

讨 论

糖尿病伤口易出现愈合不良现象，而炎症反应紊乱可能是产生这一现象的重要原因。伤口愈合期间适度的炎症反应对伤口愈合是必要的，而过度的炎症可抑制伤口愈合。炎症反应的维持主要依靠浸润的巨噬细胞不断分泌促炎细胞因子，如白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素6(IL-6)和TNF-α。在炎症过程中，巨噬细胞浸润至伤口可吞噬、清除细菌及坏死组织，同时释放细胞因子，启动伤口修复进程[7]。但如果炎症反应不消退，促炎介质持续释放，则会抑制伤口愈合。研究显示，TNF-α是抑制伤口愈合的重要促炎介质，TNF-α的过度释放可诱导成纤维细胞凋亡，抑制胶原沉积，延迟伤口愈合[5]；而系统的抗TNF-α治疗可显著促进伤口愈合[12]。

Figure 4. The expression of TNF-α in PNU-282987 group (A) and diabetes group (B) at 10, 14 and 21 d after injury. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsB.

图4糖尿病组和PNU-282987组的TNF-α表达情况

Figure 5. The number of fibroblasts at different posttraumatic time points. Immunohistochemical staining of HSP47 (fibroblast marker) in wound sample was observed at 14 d after injury (×400, scale bar=20 μm) and the number of fibroblasts at 10, 14 and 21 d after injury was counted. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsdiabetes.

图5切创后各时点成纤维细胞数量

Figure 6. The content of collagen in the wounds at different posttraumatic time points. Masson staining of wound samples was observed at 21 d after injury (×400, scale bar=20 μm) and the collagen volume fraction (CVF) of the wounds at 10, 14 and 21 d after injury was calculated. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsdiabetes.

图6切创后各时点胶原含量

α7nAChR是经典的神经元受体，但也分布于免疫细胞表面[13]。激活α7nAChR可抑制巨噬细胞释放TNF-α，减轻局部的炎症反应[8-9]。因此，α7nAChR已开始应用于炎症性疾病的治疗，诸如Crohn病、牛皮癣、类风湿性关节炎、哮喘和败血症等[9-10,14]。我们前期研究显示，在伤口愈合期间α7nAChR广泛表达于浸润的巨噬细胞，提示α7nAChR可能在皮肤损伤愈合的炎症阶段发挥重要调控作用[8]。

本研究表明，与对照组相比，糖尿病小鼠的创口愈合明显延迟。糖尿病组小鼠在切创后1～3 d的创口巨噬细胞浸润较少，TNF-α表达水平较低；而在切创5 d后，创口中的巨噬细胞数量和TNF-α的表达水平显著增多；糖尿病伤口的愈合具有炎症反应发生迟但不易消退的特征。在糖尿病伤口愈合后期，持续浸润的巨噬细胞可能导致TNF-α释放增加，抑制伤口愈合。

为了避免干扰创口早期的炎症反应，我们选择了在切创5 d后对糖尿病小鼠进行α7nAChR特异性激动剂PNU-282987的干预。与糖尿病组相比，PNU-282987组在切创后10 d、14 d和21 d的创口中TNF-α表达显著减少，而成纤维细胞数量和胶原含量增多。本研究结果提示，在糖尿病伤口愈合后期激活α7nAChR可能通过抑制巨噬细胞释放TNF-α，使TNF-α诱导的成纤维细胞凋亡减少，从而促进创口中的胶原沉积，加快伤口愈合，但具体机制仍有待进一步研究证实。此外有报道表明，敲除小鼠的α7nAChR可以促进紫外线诱导的皮肤炎症，增加损伤灶内促炎介质的释放[15]。至于糖尿病创口愈合早期的炎症反应不足现象能否通过抑制α7nAChR进行调节，尚需研究阐明。

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Activationofα7nAChRpromoteswoundhealingindiabeticmicebysuppressingTNF-αexpression

FAN Yan-yan, YE Guang-hua, LIN Ke-zhi, DONG Miao-wu, FENG Xiang-ping, HAN Jun-ge, LI Xing-biao, YU Lin-sheng

(DepartmentofForensicMedicine,SchoolofBasicMedicalScience,WenzhouMedicalCollege,Wenzhou325035,China.E-mail:yyfan998@163.com)

AIM: To explore the role of α7 nicotinic acetylcholine receptor (α7nAChR)-specific agonist PNU-282987 in promoting wound healing in diabetic mice by suppressing the expression of tumor necrosis factor α (TNF-α).METHODSA model of incised wound was established in diabetic mice or normoglycaemic mice (control). Skin samples were taken on 1 d, 3 d, 5 d, 10 d, 14 d and 21 d post-injury (5 mice in each posttraumatic interval). The numbers of macrophages and fibroblasts, the expression of TNF-α and the deposition of collagen were detected by the methods of immunohistochemistry, Western blotting and Masson staining, respectively. After incised wound was performed in the diabetic mice, PNU-282987 was applied by intraperitoneal injection at suitable posttraumatic interval. The above indexes were investigated again.RESULTSCompared with control group, the diabetic mice presented delayed wound healing. In diabe-tic mice, the infiltration of macrophages and the expression of TNF-α were significantly reduced in the early phase during wound healing, while they were significantly increased from 5 d post-injury. Besides, from 5 d to 21 d post-injury, the wounds in diabetic mice showed decreased number of fibroblasts and deposition of collagen. From 5 d post-injury, PNU-282987 was applied to diabetic mice, which significantly down-regulated the expression of TNF-α, and increased the number of fibroblasts and the content of collagen in the wounds, eventually promoted wound healing.CONCLUSIONInflammatory reactions delay wound healing in diabetic mice. Activation of α7nAChR promotes wound healing in diabetic mice by suppressing the expression of TNF-α.

Diabetes mellitus; Wound healing; α7 nicotinic acetylcholine receptor; Tumor necrosis factor α

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.017

1000- 4718(2013)06- 1053- 06

2012- 12- 25

2013- 04- 28

浙江省自然科学基金资助项目(No.Q13H150005)；温州医学院科研发展基金资助项目(No.QTJ12002)

△通讯作者 Tel: 0577-86689816; E-mail: yyfan998@163.com