Jagged1过表达促进老龄大鼠来源的内皮祖细胞向成熟内皮细胞分化*

朱光旭， 潘兴华， 宋明宝， 余争平， 庞荣清， 阮光萍， 康华莉

(1成都军区昆明总医院检验科，云南省干细胞与组织工程中心，云南 昆明 650032； 2第三军医大学新桥医院全军心血管疾病研究所，重庆 400037； 3第三军医大学军事预防医学院电磁辐射生物学效应研究所，重庆 400038)

Jagged1过表达促进老龄大鼠来源的内皮祖细胞向成熟内皮细胞分化*

朱光旭1△， 潘兴华1△， 宋明宝2， 余争平3， 庞荣清1， 阮光萍1， 康华莉2

(1成都军区昆明总医院检验科，云南省干细胞与组织工程中心，云南 昆明 650032；2第三军医大学新桥医院全军心血管疾病研究所，重庆 400037；3第三军医大学军事预防医学院电磁辐射生物学效应研究所，重庆 400038)

目的探讨上调Jagged1表达对内皮培养条件下老龄大鼠来源的内皮祖细胞(EPC)向内皮细胞分化的影响。方法脱臼处死1～2月龄和19～26月龄SD大鼠，PBS冲洗股骨和胫骨骨髓，Ficoll密度梯度离心分离单个核细胞, 应用含10% FBS的DMEM/F12培养基以差速贴壁法进行体外培养，DiI-ac-LDL与FITC-UEA-1荧光双染进行EPC特性鉴定。实验分为4组：对照组、PIRES2-EGFP转染组、PIRES2-EGFP-Jagged1转染组和未转染的年轻大鼠来源EPC组。荧光显微镜下计数GFP阳性细胞数并计算转染效率；免疫荧光、RT-PCR和Western blotting检测Jagged1 mRNA和蛋白、von Willebrand因子(vWF)及血管内皮生长因子激酶插入区受体(KDR)mRNA表达，体外血管生成实验检测EPC的血管形成能力。结果转染后Jagged1在EGFP-Jagged1组表达较对照组显著增强(P<0.01)；Jagged1过表达显著促进老龄大鼠EPC vWF与KDR mRNA表达(P<0.01)和体外血管生成能力(P<0.01); vWF与KDR mRNA表达以及体外血管生成能力在Jagged1转染组与年轻大鼠EPC组间未见有显著差别。结论Jagged1过表达促进内皮培养条件下老龄大鼠来源EPC向成熟内皮细胞分化。

Jagged1蛋白； 内皮祖细胞； 血管发生； 衰老

内皮祖细胞(endothelial progenitor cell, EPC)具有成体细胞类似的衰老生物学特性已为诸多文献证实[1-2]。我们前期研究表明，EPC修复损伤血管具有年龄依赖特性，即年轻大鼠来源EPC较老龄大鼠来源者具有更好的增殖迁移和向内皮细胞(endothelial cell，EC)分化能力[3]。Notch信号系统是进化上高度保守，控制着细胞增殖和分化等细胞命运的信号系统，该信号系统可通过Jagged1和Delta-like(Dll)家族配体识别Notch跨膜蛋白受体得以激活[4]。Conboy等[5]证实,在衰老骨骼肌细胞Notch信号活化显著减弱，通过增强Notch1信号活化可促进衰老的骨骼肌细胞再生能力。新近研究发现Jagged1缺乏会导致EPC迁移、增殖等能力减弱，并且缺血组织血管再生能力也明显降低[6]，但是目前尚不清楚Jagged1对EPC的年龄依赖性分化活性有何调节功能。本研究在老龄大鼠来源的EPC中过表达Jagged1，探讨其在EPC年龄依赖性分化中的调节作用，为临床应用EPC防治血管损伤性疾病提供部分理论和实验依据。

材 料 和 方 法

1主要材料

Sprague-Dawley(SD)大鼠(1～2月龄和19～26月龄，雌雄不限，无既往病史，均喂养于环境湿度、温度适中，饮食良好的环境)由第三军医大学实验动物中心提供，所有动物实验均经第三军医大学及成都军区昆明总医院伦理委员会批准。质粒PIRES2-Jagged1-EGFP由第三军医大学全军心血管研究所宋明宝博士惠赠(包含全长的大鼠Jagged1 cDNA序列，PIRES2-EGFP载体购自BD)。LipofectamineTM2000(Invitrogen)，DMEM/F12干粉培养基(HyClone)，内皮细胞生长添加剂(BD)，优质胎牛血清(PAA)，DiI标记乙酰化低密度脂蛋白(DiI-labeled acetylated low-density lipoprotein, DiI-ac-LDL；Molecular Probe)，FITC标记荆豆凝集素I(FITC-labeledUlexeuropaeusagglutinin, FITC-UEA-I；Vector)，Ficoll 液(Histo-paque 21083)，抗大鼠Jagged1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)和von Willebrand因子(von Willebrand factor，vWF)抗体(Santa Cruz), 荧光标记山羊抗小鼠及兔抗山羊IgG(北京中杉公司)，纤维连接蛋白(FN，Sigma), 体外血管生成试剂盒(Invitrovasculogenesis kit；Chemicon), 逆转录聚合酶链式反应试剂盒(Promega),Hot-start taq酶(TaKaRa)，倒置荧光相差显微镜 (Leica)，CO2培养箱(Harris), PCR仪(MJ)。

2方法

2.1EPC分离培养及鉴定 参照课题组前期研究，采用二次贴壁法EPC进行培养，文献报道该方法可减少循环EC及单个核细胞污染[7-8]。脱臼处死SD大鼠,无菌取出股骨和胫骨, PBS冲洗骨髓， Ficoll 液密度梯度离心 (2 000 r/ min ,30 min) 分离单个核细胞, PBS洗涤后，以含15%FBS的DMEM/F12(含内皮细胞生长添加剂100 mg/L，肝素100 mg/L，青霉素1×105U/L，链霉素100 mg/L)重悬, 1.5×106/cm2接种于75 cm2培养皿，37 ℃、5 % CO2条件培养，细胞贴壁24 h (弃早期贴壁细胞) 后转移未贴壁细胞悬液到新的经纤维连接蛋白包被的无菌培养瓶或培养板继续培养，使细胞再次贴壁生长，4 d后弃未贴壁细胞，以后每2 d换液1次。二次贴壁细胞培养12 d后，DiI-ac-LDL (10 mg/L)及FITC-UEA-I (10 mg/L)避光孵育，置荧光显微镜下观察；另取24孔板培养细胞行vWF荧光免疫细胞化学染色。

2.2脂质体介导的基因转染 当二次贴壁的老龄大鼠来源EPC培养达到70%～80%融合时，按照LipofectamineTM2000说明对细胞进行转染，简言之，用100 μL Opti-MEM稀释LipofectamineTM2000(6 μL)和DNA(1.5 μg)，混匀，室温放置5～10 min，将脂质体-DNA复合体加入到24孔板培养的EPC后孵育6 h， PBS清洗后重新用含15% FBS的DMEM/F12培养基进行培养。转染实验分为4组：未转染(对照)组、PIRES2-EGFP转染组、PIRES2-EGFP-Jagged1转染和未转染的年轻大鼠来源EPC(YE)组。转染18 h后，200倍倒置荧光显微镜下计数细胞数，并在同一视野视野在激发波长为488 nm的荧光下检测GFP的表达，计数5个视野表达绿色荧光的细胞数和总细胞数计算获得转染细胞效率。

2.3Western blotting及荧光免疫细胞化学检测Jagged1表达 转染后72 h，用4 ℃预冷的PBS 洗细胞3 次，加入预制的含PMSF 裂解液，冰上裂解30 min，裂解后，将细胞碎片和裂解液移至离心管。4 ℃、16 000 r/min 离心20 min，收集上清，取其中少量测蛋白浓度(BCA 法) ，取等量预处理的蛋白样品上样，恒压81V 进行SDS-PAGE 电泳，电转至PVDF 膜，5%脱脂奶粉-PBST 室温封闭1 h 后，加入羊抗大鼠Jagged1 抗体(1∶1 000) 、小鼠抗大鼠GAPDH(1∶1 000) 4 ℃孵育过夜，再与HRP 标记的兔抗羊IgG和抗鼠IgG 37 ℃孵育1 h，化学发光显色后用凝胶成像系统扫描, 半定量分析显影带，目的蛋白量以GAPDH 相对量表示；取部分培养的转染细胞进行Jagged1免疫细胞化学染色，同型IgG抗体染色作为阴性对照。

2.4RT-PCR检测vWF和血管内皮生长因子激酶插入区受体(kinase insert domain receptor,KDR)mRNA表达 转染后96 h按Tripure 说明书提取总RNA，在A260/A280条件下进行RNA 纯度鉴定和定量,并用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳进一步确认RNA 质量。取总RNA 3.2 μg 逆转录合成cDNA 后进行半定量PCR反应,以GAPDH作内参照。反应条件为95 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min ,35个循环后,72 ℃ 7 min。vWF(XM_342759) 上游引物为5’-ctg tgc tgc cca gag tat ga-3’,下游引物为5’-ccc ctt cgt gga gaa cat aa-3’,目标片段514 bp；KDR(NM_013062)上游引物为5’-gct ccg gaa aca att ttt ga-3’,下游引物为5’- tct gtc tgg ctg tca tct gg-3’,目标片段560 bp；GAPDH(NM_017008)上游引物为5’-tcc cat tct tcc acc ttt ga-3’,下游引物为5’-tgt gag gga gat gct cag tg-3’,目标片段253 bp，29 个循环；退火温度55 ℃。反应结束后各取PCR 产物4 μL 进行1.7%琼脂糖电泳,并用Gel Doc 2000 凝胶图像分析仪扫描，PCR 产物量以吸光度值×面积表示，目的片段与GAPDH吸光度比值作为目的片段mRNA 的相对含量,并以年轻大鼠来源的EPC及腹主动脉EC作为阳性对照。

2.5体外血管生成实验检测EPC的血管生成能力 转染后96 h, 采用体外血管生成试剂盒检测血管生成能力。将ECMatrixTM胶液和ECM 10×稀释液置于4 ℃冰箱过夜，使之冻融。每900 μL ECMatrixTM加入100 μL ECM 10×稀释液，混匀。将上述溶液加入96孔板，每孔50 μL，37℃孵育1 h成胶，0.25%胰蛋白酶消化培养的转染EPC，重新悬于DMEM/F12培养基，以5×103cells/well接种于ECMatrixTM胶上37 ℃孵育12 h，倒置显微镜下观察血管生成情况。体外血管生成实验的形态学评分标准参照我们前期实验进行[9]，具体标准是：0分，细胞呈单个存在；1分，细胞开始迁移并自我排列；2分，可以见到毛细管，但是尚无出芽；3分，可见到新毛细管出芽；4分，开始闭合形成多边形；5分，形成网状结构。

3统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示, 使用SPSS 10.0软件进行组间单因素方差分析,以P< 0.05为差异有统计学意义。

结 果

1体外培养骨髓EPC的特征

二次贴壁培养的骨髓EPC大多呈梭形或卵圆形，2周后细胞逐渐呈融合生长状态,见图1A、B。形态上年轻组EPC较老年大鼠来源更为均一，贴壁细胞数及增殖速度均明显高于老年组，与课题组前期研究结果一致。EPC培养12 d后进行DiI-ac-LDL(图1E)及FITC-UEA-I(图1F)染色，随机挑选5个视野计数双染阳性细胞百分率，结果显示双染阳性率为(80.40±6.95)%。培养12 d，免疫细胞化学显示未染色培养细胞及同型对照均未见有明显荧光(照片未显示),而EPC 行vWF染色后可见部分vWF表达,见图1G。

Figure 1. Characteristics of bone marrow-derived endothelial progenitor cells (EPC). A: secondary attached cells, the arrow showing the network of EPC; B: EPC after 14 d of culture; C: DiI-ac-LDL negative control; D: FITC-UEA-I negative control; E: DiI-ac-LDL positive cells; F: FITC-UEA-I positive cells; G: vWF immunostaining for EPC after 12 d of culture; I: vWF immunostaining for cultured abdominal aorta endothelial cells; H and J: DAPI-labeled cell nuclei corresponding to G and I, respectively.

图1培养骨髓EPC的生长特征

2转染后Jagged1在老龄大鼠来源EPC中的表达

转染后18 h,实验观察到EGFP和EGFP-Jagged1组均可见EGFP表达(图2Ab)， 两者未见明显差异，对照组未见表达(图2Aa)，转染效率约40%。转染后72 h, 免疫细胞化学显示EGFP-Jagged1组Jagged1表达显著增强(图2Ae),而EGFP组(图2Ac)和对照组(图2Ad)仅见微弱Jagged1表达。Western blotting显示，Jagged1在EGFP-Jagged1组(0.374±0.024)和YE组(0.381±0.030)表达同样显著高于EGFP组(0.139±0.021)和对照组(0.141±0.012;P<0.01),见图2B。

3Jagged1表达上调促进老龄大鼠EPC中vWF及KDRmRNA表达

转染后96 h, EGFP-Jagged1组见vWF(2.01±0.17)及KDR(2.21±0.13)表达较对照组(分别为1.21±0.12和1.36±0.17)显著增高(P<0.01)，而对照组与EGFP组间未见显著差别；YE组vWF(2.24±0.15)和KDR(2.69±0.19)以及EC组 vWF(2.26±0.21)和KDR(2.82±0.29)与EGEP-Jagged1组之间未检测到显著差异，但均显著高于对照及EGFP组,见图3。

4上调Jagged1表达促进老龄大鼠EPC血管形成能力

EGFP-Jagged1转染组评分(3.36±0.57)显著高于对照及EGFP转染组(2.46±0.52)(P<0.05)，对照组与EGFP转染组之间未见显著差别。YE组血管形成能力(3.86±0.49)与EGFP-Jagged1转染组相比无显著差别，这2组评分仍然显著低于EC组(4.98±0.19；P<0.01),见图4。这表明Jagged1过表达显著促进老龄大鼠来源EPC的血管新生能力，同时也提示在检测时限内，Jagged1过表达的老龄大鼠EPC以及年轻大鼠来源的EPC均未完全呈现成熟EC所具备的生物学特性。

讨 论

干、祖细胞反应性减弱是衰老引发退变的重要特征之一，主要表现在随着年龄的增长，干细胞和祖细胞在细胞增殖、迁移等能力下降，导致组织再生能力减弱[1-2]。然而由衰老引起的干、祖细胞反应性减弱具有潜在可逆性。课题组前期研究证实EPC具有类似成体细胞衰老的生物学特性，即老年大鼠来源的EPC在增殖迁移和向EC分化方面能力弱于年轻大鼠EPC，但是当置入年轻环境，老年大鼠来源EPC的活性可被部分恢复[3]。针对其它组织的干细胞也有类似报道。Conboy等[10]证实年轻环境可显著促进骨骼肌干细胞活性恢复,有效增强其参与骨骼肌组织再生能力。Notch信号是在进化上高度保守、控制细胞增殖和迁移等细胞命运的信号转导系统，Jagged1是该信号途径配体之一，可激活细胞膜Notch信号受体引起受体构象改变后裂解，产生细胞内结构域释放后转位到细胞核，在核内与转录抑制子CBF1结合，启动Notch/CBF1调节的下游基因转录，从而调控增殖和分化等细胞活性[4]，文献已报道通过增强Notch1信号活化可以恢复和促进衰老骨骼肌细胞的再生能力[5]，新近研究揭示Jagged1缺乏会导致EPC在迁移增殖等方面能力显著减弱，且参与缺血组织血管再生能力也明显降低[6]，然而Notch1信号在EPC年龄依赖性分化活性调节上有何功能迄今尚未明确。

Figure 2. EGFP and Jagged1 expression in aged rat-derived EPC after transfection. A: EGFP observation and Jagged1 immunocytochemical staining.a:EGFP negative control; b: EGFP expression in EGFP and EGFP-Jagged1 transfection groups; c: Jagged1 expression in control group; d: Jagged1 expression in EGFP transfection group; e: Jagged1 expression in EGFP-Jagged1 transfection group; f: Jagged1 expression in cultured young rat-derived EPC. B: Jagged1 protein expression in different groups detected by Western blotting. Con: control; PE: PIRES2-EGFP transfection; PEJ: PIRES2-EGFP-Jagged1 transfection; AE: aged rat-derived EPC; YE: young rat-derived EPC.Mean±SD.n=4.**P<0.01vsCon or PE.

图2EGFP及Jagged1在老龄大鼠EPC转染后表达

Figure 3. Jagged1 overexpression promoted vWF and KDR mRNA expression in aged rat-derived EPC. Con: control; PE: PIRES2-EGFP transfection; PEJ: PIRES2-EGFP-Jagged1 transfection; AE: aged rat-derived EPC; YE: young rat-derived EPC; EC: cultured abdominal aorta endothelial cells.Mean±SD.n=4.**P<0.01vsCon or PE.

图3Jagged1过表达促进老年大鼠来源EPC中vWF及KDRmRNA表达

Figure 4. Up-regulated Jagged1 improved the tube formation ability of EPCinvitro. A: control and EGFP transfection group; B: EGFP-Jagged1 transfection group; C: young rat-derived EPC group; D: cultured abdominal aorta endothelial cell group.Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsA;△△P<0.01vsD.

图4Jagged1过表达促进老龄大鼠来源EPC的体外血管形成能力

本研究应用基因转染技术，以年轻大鼠来源EPC为对照，通过增强老龄大鼠来源EPC内Jagged1表达来探讨在内皮培养条件下Jagged1对EPC分化年龄相关性的调节作用。免疫荧光显示年轻大鼠EPC Jagged1表达强于老龄组，这与近期研究显示Jagged1在EC中的表达有相似特点，即老年大鼠EC 表达Jagged1显著低于年轻大鼠EC[11]。实验观察到转染后EGFP和EGFP-Jagged1组均有EGFP表达，EGFP-Jagged1组Jagged1表达显著增强，表明转染Jagged1已成功表达于老龄大鼠来源EPC。vWF和KDR广泛表达于成熟EC，是成熟EC的重要特征性标志。RT-PCR揭示Jagged1转染组vWF 及KDR mRNA表达较对照组显著增高。vWF是EC特异性分泌的糖蛋白；体外实验显示KDR可结合基质金属蛋白酶，促进管状结构形成，与EC参与血管损伤修复和再生能力密切相关[12]。Jagged1过表达显著促进老龄大鼠来源EPC内vWF和KDR表达，表明Jagged1过表达可以显著促进老龄大鼠EPC内皮分化能力。进一步的体外血管生成实验观察到Jagged1转染组评分显著高于对照组及EGFP转染组，表明上调Jagged1表达显著促进了老龄大鼠来源EPC的血管形成能力，提示既往研究发现的老龄大鼠EPC修复血管损伤内膜能力较年轻大鼠EPC弱可能与Jagged1表达不足导致老龄大鼠来源EPC向EC分化能力减弱有关。

已有研究证实Notch信号在细胞分化调节上发挥了重要调节功能,新近文献报道Jagged1可调节血管瘤干细胞向血管平滑肌细胞分化[13]。Jagged1/Notch1途径还可以通过细胞间作用调节细胞增殖和分化生物学特性。通过共培养内皮和平滑肌细胞，Xia等[14]研究表明Jagged1可通过Notch3途径调节平滑肌分化。武晓静等[15]证实内皮细胞Jagged1下调显著促进PDGF诱导的大鼠平滑肌细胞增殖和迁移。然而Jagged1如何调控EPC向EC分化的详细机制尚不清楚。孟晓等[16]在EPC向EC分化过程中观察到Notch信号活化，提示该信号途径与EPC内皮分化紧密相关；Kamei等[17]证实Jagged1在调节EPC相关的血管发育过程中起重要作用，Jagged1+/+EPC较Jagged1-/-EPC不仅显示较强的促血管再生效应，且能促进形态正常血管的稳定性。目前仅有的研究远不足以阐明Notch1调控EPC内皮分化的机制。本实验揭示内皮培养条件下上调Jagged1表达可以促进老龄大鼠EPC向EC分化，为老龄个体来源EPC应用于临床提供了部分实验依据，但是详细机制尚需进一步探索，另一方面，EPC修复血管损伤内膜是一极其复杂的生理过程，本次实验也仅局限于部分离体研究，尚需在体研究加以验证。

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OverexpressionofJagged1promotesagedrat-derivedendothelialproge-nitorcellsdifferentiatingintomatureendothelialcells

ZHU Guang-xu1, PAN Xing-hua1, SONG Ming-bao2, YU Zheng-ping3, PANG Rong-qing1, RUAN Guang-ping1, KANG Hua-li2

(1DepartmentofClinicalLaboratory,StemCellandTissueEngineeringCenterofYunnanProvince,PLAKunmingGeneralHospital,ChengduMilitaryAreaCommand,Kunming650032,China;2CardiovascularInstituteofXinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China;3InstituteofBiologicalEffectofElectromagneticRadiation,SchoolofMilitaryPreventiveMedicine,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China.E-mail:zhguxu2001@aliyun.com;xinghuapan@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the effect of Jagged1 overexpression on endothelial cell-directional differentiation of aged rat-derived endothelial progenitor cells (EPC).METHODSMononuclear cells were obtained from bone marrow of young (1 to 2 months old) or aged (19 to 26 months old) Sprague-Dawley rats and cultured in DMEM/F12 medium supplemented with 10% FBS. EPC were characterized as double positive for DiI-ac-LDL uptake and lectin binding. The experiments were divided into control group, PIRES2-EGFP transfection group, PIRES2-EGFP-Jagged1 transfection group and young rat-derived EPC group in which transfection was not performed. The GFP expression positive cell number was acquired by fluorescence microscopy and the transfection efficiency was calculated. Immunofluorescence, RT-PCR and Western blotting were used to detect the mRNA and protein expression.Invitrovasculogenesis kit was used to test the tube formation ability of EPC.RESULTSEGFP-Jagged1 transfection induced a significant increase in the expression of Jagged1 in aged rat-derived EPC (P<0.01). Compared with the control, Jagged1 overexpression markedly enhanced the mRNA expression of von Willebrand factor (vWF) and kinase insert domain receptor (KDR) of vascular endothelial grouth factor vWF in aged rat-derived EPC (P<0.01) and improved the EPC-related tube formation (P<0.01). No significant difference between Jagged1 transfection and young rat-derived EPC groups in vWF and KDR mRNA expression and the ability of tube formation was found.CONCLUSIONIn endothelial cell-conditioning medium, Jagged1 overexpression significantly promotes aged rat-derived EPC differentiation into mature endothelial cells.

Jagged1 protein; Endothelial progenitor cells; Vasculogenesis; Aging

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.002

1000- 4718(2013)06- 0969- 06

2012- 12- 14

2013- 04- 18

“973”基础研究规划项目(No.2012CB518100)；国家自然科学基金资助项目(No.81170316)

△通讯作者 朱光旭 Tel： 0871-64774920； E-mail： zhguxu2001@aliyun.com； 潘兴华 Tel： 0871-64774920； E-mail： xinghuapan@aliyun.com