不同年龄小鼠缺血性心力衰竭后心室重塑程度的比较*

沈 鑫， 马依彤， 杨毅宁， 刘 芬， 于子翔， 陈邦党， 陈 铀， 黄 莺

(新疆医科大学第一附属医院冠心病一科，新疆 乌鲁木齐 830054)

不同年龄小鼠缺血性心力衰竭后心室重塑程度的比较*

沈 鑫， 马依彤△， 杨毅宁， 刘 芬， 于子翔， 陈邦党， 陈 铀， 黄 莺

(新疆医科大学第一附属医院冠心病一科，新疆 乌鲁木齐 830054)

目的研究不同年龄小鼠缺血性心衰后心室重塑程度的变化。方法选择3月龄和18月龄的雄性C57BL/6J小鼠共100只，每个月龄组50只，在2组中分别随机选取 40只，结扎左冠状动脉定量控制心梗面积，建立稳定缺血性心衰模型，每组其余10只作为假手术组，于术后8周行心脏超声评价各组心功能变化；称量全心脏及左心室重量并计算左心室质量指数(LVMI)；免疫组化检测心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原表达，Masson染色检测心肌纤维化的程度并计算心肌间质胶原分数(CVF)。结果与低龄组相比，老龄组心脏破裂率(18%vs10%)和心力衰竭死亡率(22%vs10%)均高于低龄组(P<0.05)；老龄组心室腔明显增大，心率较快，左室短轴收缩功能障碍更明显(P<0.05)；老龄组LVMI明显增加(P<0.05)；老龄组CVF、Ⅰ型胶原的表达以及Ⅰ/Ⅲ型胶原的比值显著高于低龄组(P<0.05)。结论老龄小鼠缺血性心衰后心肌胶原分布异常，心室重塑程度更重，心功能降低更明显。

心力衰竭； 心室重塑； 年龄； 胶原

心力衰竭(heart failure，HF)是缺血性心脏病中预后较差的并发症之一，临床研究证实老龄是缺血性心力衰竭发生的独立危险因素，约80%以上的心力衰竭发生于年龄65岁以上的患者[1]，且老龄心肌对缺血缺氧造成的损伤更加敏感，预后更差。所以，开展老龄缺血性心力衰竭的发病机制研究显得尤为重要，为寻找新的干预措施以提高老龄心衰患者的生存率及生活质量具有重要现实意义。本研究利用不同年龄的缺血性心衰小鼠模型，研究不同年龄小鼠缺血性心衰后心室重塑程度变化。

材 料 和 方 法

1动物、试剂与仪器

近交系C57BL 低龄(3月龄)和老龄(18月龄)小鼠各50只，共100只，体重20～30 g，12 h∶12 h昼夜循环饲养，由新疆医科大学实验动物中心提供，所有操作程序经过动物伦理委员会批准。免疫组化试剂盒及Masson三色染色试剂盒购自福建迈新技术有限公司，Ⅰ、Ⅲ型胶原抗体购自Abcam。Hardvard 687小动物呼吸机购自Hardvard。显微镜购自Leica。

2小鼠缺血性心力衰竭模型的制作

依据文献[2]建立缺血性心衰动物模型。腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)、甲苯噻嗪(20 mg/kg)、阿托品(1.2 mg/kg)的混合液，麻醉生效后接呼吸机控制呼吸。左侧卧位固定，左第五肋间切开撑开胸腔，暴露心脏，看见左冠状动脉后用6～0号丝线结扎左冠状动脉，定量控制心肌梗死范围，形成左心室中等范围梗死面积(40%～45%)，假手术组为同期开胸但不结扎冠脉，余过程同心力衰竭组。术后6周存活小鼠形成相对稳定的缺血性心力衰竭模型[3]。为使模型更为稳定，故将时间延长2周后以8周存活的小鼠为稳定的缺血性心力衰竭模型。

3术后死亡率的观察

分别在术后24 h内、术后1周内、术后2～8周内观察小鼠的死亡率，并对1周内和术后2～8周内死亡的小鼠进行尸体解剖，心脏附近包绕大量血凝块，或者可以在梗死的室壁上见到破裂口即为心脏破裂死亡；双肺淤血，心脏重度扩大伴或不伴心包积液，梗死区域扩大且呈暗红色即为心力衰竭死亡。

4心脏超声评价心功能

术后8周用惠普5500型彩色多普勒超声心动图仪及15 MHz高频线阵超声探头经胸检测并记录以下指标：心率(heart rate，HR)、左室收缩末期内径(left ventricular end-systolic diameter，LVESD)、左室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)、左室舒张期外径(external left ventricular diastolic diameter，EXLVDD)、收缩期和舒张期的前后室壁厚度(thickness of anterior wall of systole，Aws；thickness of posterior wall of systole，Pws；thickness of anterior wall of diastole, Awd； thickness of posterior wall of diastole，Pwd)和短轴缩短率(fractional shortening，FS),FS(%)=(LVEDD-LVESD)/LVEDD×100%[3]。

5病理学检测

颈椎脱臼法处死小鼠，迅速取出心脏和肝脏，沿房室沟和室间隔分离出左心室、右心室、心房，将其分别称重，计算左心室质量指数(left ventricular mass index，LVMI)，LVMI=左心室重量/全心重量；以10%中性甲醛溶液固定左心室，各浓度乙醇梯度脱水、二甲苯透明后石蜡包埋，切片(5 μm)。HE染色观察梗死区、交界区瘢痕形成情况及心肌细胞存活的情况；Masson染色(心肌细胞呈红色，胶原为蓝色)鉴定并计算心肌间质胶原分数(collagen volume fraction, CVF)， CVF=心肌胶原面积/所测视野面积；免疫组化测定心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达，每张切片随机选取5个视野，取平均值，应用图像分析软件(Image-Pro Plus 6.0)分析图片数据，并计算Ⅰ/Ⅲ型胶原比值。

6统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示，用SPSS 16.0软件处理分析，组间均数比较用方差分析，百分率的比较采用2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1各组死亡率观察

术后24 h内低龄组死亡3只，老龄组死亡4只；术后7 d内低龄组5只死于心脏破裂，3只死于心力衰竭；老龄组9只死于心脏破裂，4只死于心力衰竭；术后1～8周内，低龄组2只死于心力衰竭，老龄组7只死于心力衰竭，假手术组全部存活。老龄组的总死亡率(48%vs26%)、心脏破裂死亡率(18%vs10%)和心力衰竭死亡率(22%vs10%)均显著高于低龄组(P<0.05),见图1。

Figure 1. Mortality of different reasons in the 2 groups.*P<0.05vsyoung group.

图12组小鼠不同原因的死亡率比较

Figure 2. Pathological results of the hearts in the 2 groups (×400).

图2各组心衰小鼠心肌组织病理学结果

2心脏超声结果

各年龄心衰组在8周时均出现明显的梗死区变薄扩张和收缩功能障碍，与同龄假手术组相比，两心衰组的LVEDD和LVESD明显增大(P<0.05),HR明显增快(P<0.05)，FS均明显降低(P<0.05)；与低龄心衰组相比，老龄心衰组心室腔明显增大,HR较快,FS降低更明显,Pwd低于低龄组(P<0.05),见表1。

表1 术后8周心脏超声结果

*P<0.05vscontrol at the same age；△P<0.05vsHF in young group.

3病理学结果

各年龄组分别与同龄假手术组相比，左室、右室和心房重量明显增加(P<0.05)，LVMI明显升高(P<0.05)，肝脏重量显著降低(P<0.05)；老龄组左室重量及LVMI要显著高于低龄组(P<0.05)，见表2。与同龄假手术组相比，两心衰组CVF明显增高(P<0.05)，Ⅰ、Ⅲ型胶原表达明显增高(P<0.05)；与低龄心衰组相比，老龄心衰组CVF、Ⅰ型胶原以及Ⅰ/Ⅲ比值明显增高(P<0.05)，但2组Ⅲ型胶原的表达差异无统计学意义(P>0.05)，见图2、表3。

表2 术后8周低龄和老龄小鼠器官重量及LVMI比较

LV: left ventricle； RV: right ventricle； AT: atrium.*P<0.05vscontrol at the same age；△P<0.05vsHF in young group.

表3 术后8周各组心肌CVF、Ⅰ和Ⅲ型胶原表达及Ⅰ/Ⅲ比值的比较

*P<0.05vscontrol at the same age；△P<0.05vsHF in young group.

讨 论

年龄是心血管病的重要危险因素之一，随着年龄的增加，心功能及其储备能力下降，对于伴有基础性心脏病的老年人来说，更容易发生心力衰竭，然而心力衰竭是个复杂的病理生理过程，老龄心力衰竭患者心室重塑更重，目前机制不是很清楚。研究表明，胶原重建在心室重塑过程中起了非常重要的作用[4-6]。因此，本研究利用不同年龄小鼠建立缺血性心力衰竭模型，观察了老龄小鼠心衰后左室重塑的程度，并探讨了各年龄组心衰心肌胶原的表达变化，阐释老龄鼠心衰后左室重塑更重的可能原因。

心力衰竭是一个进行性发生发展的过程，涉及复杂的病理生理机制，目前认为，体内神经激素系统长期的过度激活，导致心肌及间质的重塑及细胞凋亡，形成了心衰病理生理的重要环节，阻断神经激素的激活、延缓、逆转心室重塑的病理生理过程与恶性循环应是控制心衰发展的关键[7]。左心室重塑的病理改变一般有以下两个方面：一是心肌细胞的肥大、坏死和凋亡，二是成纤维细胞的增生和心肌间质纤维化。而心肌纤维化在心力衰竭的发生和发展中起重要作用。心肌纤维化多体现于心肌细胞外基质(extracellular matrix，ECM)胶原纤维过量积聚、胶原含量或成分比例发生变化。正常心肌中胶原主要是Ⅰ、Ⅲ型胶原(占总胶原90%以上)，Ⅰ型胶原属于成熟型胶原， 抗张强度大， 伸展及回弹性较小；Ⅲ型胶原属于胚胎型胶原，伸展及回弹性较大，抗张性较差[8-9]，二者是构成ECM主要成分和心肌僵硬的决定性因素。心肌梗死后由于修复性的纤维化形成梗死区疤痕，而非梗死区则呈现反应性纤维化，但心肌胶原含量的2～3倍升高可导致心室舒张期硬度增加和充盈异常，4倍以上的升高可导致心室收缩力的下降[10]。本研究在小鼠心衰模型中发现，无论是低龄还是老龄组，心功能均显著降低，LVMI明显升高，而造成的主要原因是心肌纤维化，胶原沉积导致心肌僵硬度增加，收缩功能障碍。本实验结果显示心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原均大量的沉积，以Ⅰ型胶原为主，在梗死区域、交界区及非梗死区可见交错成网状穿插于间质的胶原纤维，相比低龄组，老龄组胶原沉积更为明显，Ⅰ型胶原的沉积约为低龄组的2倍，但是Ⅲ型胶原的增加与低龄组相比无明显统计学差异，这导致Ⅰ/Ⅲ胶原比值显著高于低龄组，毛宇彬等[11]利用大鼠心梗模型探讨心梗不同时期心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原重建研究中发现心梗35 d后左室Ⅰ型胶原的增加明显，3 d时Ⅲ型胶原的增加明显，35 d时Ⅲ型胶原的增加的幅度要低于3 d。另外，我们在早期一项年龄和心肌梗死后心脏破裂及心室重塑的研究中也发现，老龄小鼠胶原沉积的速率要显著高于低龄小鼠[12]，结合本实验的结果，我们认为老龄鼠左心室重塑时由于Ⅲ型胶原的表达未能及时升高，导致Ⅰ型胶原过度沉积，Ⅰ/Ⅲ胶原比值过度升高，使得心室僵硬度过度增加，从而使得心功能更差，心室重塑更为严重。另一方面，在本研究中发现小鼠肝脏重量的减轻，推测是由于慢性心力衰竭的存在，小鼠的术后进食明显减少，并发生一定的营养代谢障碍。因此，如果能采用有效的干预措施在老龄心室重塑进程中减少胶原的进一步沉积，将有可能延缓心室重塑的进程，从而降低死亡率，改善心功能，改善预后。

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Effectsofdifferentagesonventricularremodelingafterischemicheartfailureinmice

SHEN Xin, MA Yi-tong, YANG Yi-ning, LIU Fen, YU Zi-xiang, CHEN Bang-dang, CHEN You, HUANG Ying

(FirstDepartmentofCoronaryHeartDisease,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China.E-mail:myt-xj@163.com)

AIM: To observe ventricular remodeling induced by ischemic heart failure in the mice at different ages.METHODSThree-month-old (young group,n=50) and 18-month-old (old group,n=50) male C57BL/6J mice were selected in the study. Forty mice underwent ligation of left coronary artery with certain infarct size, and 10 were sham-operated for control. Echocardiography was performed after 8 weeks of infarction. All mice were killed and the hearts were collected for examinations. Masson trichrome staining was used to detect myocardial fibrosis. The expression of type I and type Ⅲ collagens was measured by the method of immunohistochemistry.RESULTSThe incidences of cardiac rupture (18%vs10%,P<0.05) and heart failure (22%vs10%,P<0.05) were significantly higher in aged mice than those in young mice. The degrees of left ventricular dilation, contractile dysfunction and heart rate were significantly higher in aged mice than those in young mice (P<0.05). The left ventricular mass index, collagen volume fraction, the expression of type I collagen and ratio of type Ⅰ/Ⅲ collagens were significantly increased in aged mice as compared with young mice (P<0.05).CONCLUSIONAfter heart failure, aged mice show abnormal collagen distribution, and suffer from worse cardiac functions and more serious ventricular remodeling.

Heart failure; Ventricular remodeling; Age; Collagen

R541.4

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.005

1000- 4718(2013)06- 0988- 05

2012- 11- 13

2013- 03- 11

973计划前期研究专项(No.2010CB535013)；国家自然科学基金资助项目(No.81060025)；高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(No.20106517110002)；新疆医科大学第一附属医院科研奖励基金资助项目(No.2010YFY25)

△通讯作者 Tel: 0991-4365381; E-mail: myt-xj@163.com