AEG-1表达下调对人宫颈癌细胞细胞周期和侵袭能力的影响及其机制*

秦瑞英， 夏永华， 任艳芳， 潘 莹， 杨 君， 王慧玲， 王玉红

(新乡医学院第一附属医院 1妇产科， 2皮肤科， 河南 新乡 453100; 3新乡医学院第三附属医院妇产科，河南 新乡 453003)

AEG-1表达下调对人宫颈癌细胞细胞周期和侵袭能力的影响及其机制*

秦瑞英1△， 夏永华2， 任艳芳1， 潘 莹3， 杨 君1， 王慧玲1， 王玉红1

(新乡医学院第一附属医院1妇产科，2皮肤科， 河南 新乡 453100;3新乡医学院第三附属医院妇产科，河南 新乡 453003)

目的研究星形细胞上调基因1(astrocyte elevated gene-1，AEG-1)在人宫颈鳞癌细胞和组织中的表达，探讨AEG-1表达下调对宫颈癌SiHa细胞细胞周期和侵袭能力的影响，并分析其可能的分子机制。方法采用Western blotting检测正常宫颈组织、宫颈鳞癌组织、HeLa、SiHa和CaSki细胞中AEG-1蛋白的表达。将对照siRNA和AEG-1 siRNA分别转染SiHa细胞，利用Western blotting检测SiHa细胞中AEG-1蛋白的表达，采用流式细胞术检测细胞周期分布的变化，采用Boyden小室检测细胞侵袭能力的变化，最后采用Western blotting检测cyclin D1、细胞周期素依赖性激酶 2(CDK2)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白表达的变化。结果宫颈鳞癌组织中AEG-1蛋白表达显著高于正常宫颈组织(P<0.05)，同时3株宫颈癌细胞中AEG-1蛋白表达均显著高于正常宫颈组织，其中SiHa细胞中AEG-1蛋白表达最高(P<0.05)。此外，AEG-1 siRNA能显著下调SiHa细胞中AEG-1蛋白的表达(P<0.05)，其表达下调能明显促使SiHa细胞在G0/G1期的比例增加和降低其侵袭能力。Western blotting结果表明，AEG-1 siRNA组中cyclin D1、CDK2和MMP-9蛋白的表达均显著低于未处理组和对照siRNA组(P<0.05)。结论AEG-1在宫颈癌中的高表达可能与宫颈癌的发生发展密切相关，其表达下调介导的细胞周期静止和侵袭能力降低可能与cyclin D1、CDK2和MMP-9蛋白表达下调密切相关。

星形细胞上调基因1； 宫颈肿瘤； 小干扰RNA； 细胞周期； 肿瘤侵袭

星形细胞上调基因1(astrocyte elevated gene-1，AEG-1)最初在人胎儿星形细胞中作为人免疫缺陷病毒1(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)诱导基因被鉴定[1]。在2004年，研究人员采用噬菌体筛选表明AEG-1介导的小鼠乳腺癌细胞向肺转移，提示AEG-1与肿瘤的发生发展相关[2]。进一步研究表明，AEG-1作为癌基因已经被证实在许多人类的肿瘤中过表达，包括食管鳞癌[3]、肝癌[4]、非小细胞肺癌[5]、乳腺癌[6]、神经母细胞瘤[7]、肾癌等[8]。然而，检索国内外文献发现迄今为止尚未见AEG-1在宫颈癌中的研究报道，因此在本研究中，我们检测宫颈癌细胞和组织中AEG-1蛋白的表达，并利用脂质体将AEG-1 siRNA转染宫颈癌细胞，研究其表达下调对宫颈癌细胞周期和侵袭能力的影响，并分析AEG-1表达下调介导的细胞周期素D1(cyclin D1)、细胞周期素依赖性激酶2(cyclin-dependent kinase 2,CDK2)和基质金属蛋白酶 9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)蛋白表达的变化，该研究旨在为以AEG-1为靶点的宫颈癌分子靶向治疗提供理论依据。

材 料 和 方 法

1材料

人宫颈鳞癌组织和正常宫颈组织均通过病理学证实，取自新乡医学院第一附属医院，并经液氮保存备用。人宫颈癌细胞株HeLa、SiHa和CaSki购自中国典型培养物保藏中心。DMEM培养液、胰酶和胎牛血清均购自Gibco；兔多克隆抗体AEG-1、AEG-1 siRNA和对照siRNA均购自Zymed，鼠单克隆抗体cyclin D1、CDK2及MMP-9购自Santa Cruz；细胞裂解液购自宝生物工程(大连)有限公司。

2细胞培养、转染及分组

HeLa、SiHa和CaSki细胞复苏后置于含10%胎牛血清DMEM培养液中培养，当细胞传代到细胞状态稳定后，采用Western blotting检测3株细胞中AEG-1蛋白的表达。将上述AEG-1表达量最高的SiHa细胞培养至细胞融合度为90%左右时，将AEG-1 siRNA和对照siRNA采用脂质体介导法转染至SiHa细胞，转染后将细胞分为3组进行相关实验：未处理组(不作任何处理)、对照siRNA组(利用对照siRNA转染)和AEG-1 siRNA组(采用AEG-1 siRNA转染)。

3细胞周期分析

收集转染后48 h的3组宫颈癌SiHa细胞，每组细胞数为1×106个。离心后采用PBS漂洗细胞3次，接着将细胞放置于4 ℃ 70%冰乙醇中固定30 min，采用预冷的PBS漂洗3次，然后重悬细胞于含40 μg碘化丙啶和100 μg RNase A的PBS溶液中，于37 ℃孵育30 min。最后用流式细胞仪检测3组样品中的DNA含量。

4Boyden小室体外侵袭实验

收集转染后48 h的3组宫颈癌SiHa细胞，每组细胞数为105个。将收集的细胞离心后分别重悬于含有0.2%的胎牛血清的800 μL的培养基中，依次接种至Boyden 小室的上层，继续培养6 h。然后收集滤膜下层的细胞，用甲醇固定，并通过HE染色观察下层细胞的数量，最后通过30个视野(×200)计算滤膜下层的细胞数，评估其侵袭的细胞数量。

5Westernblotting检测蛋白的表达

收集转染后48 h的3组宫颈癌SiHa细胞，利用细胞裂解液提取总蛋白，并采用Bradford法测定各组蛋白浓度。将50 μg总蛋白在上样缓冲液中煮5～10 min，采用10% SDS-PAGE电泳进行蛋白分离，接着将凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜(NC)上。将NC用含5%脱脂奶粉的TBST于室温封闭2 h，分别加Ⅰ抗(AEG-1、cyclin D1、CDK2、MMP-9和β-actin;按1∶200稀释)于含5%脱脂奶粉的TBST中，于4 ℃过夜孵育，接着用TBST洗膜3次，每次5 min，洗膜结束后加Ⅱ抗室温孵育2 h，然后曝光。最后用Gene Tools软件分析蛋白相对表达量(目的基因表达量与内参照β-actin表达量的比值)。

6统计学处理

采用统计学软件SPSS 13.0分析，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，3组之间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1宫颈鳞癌组织和细胞中AEG-1蛋白表达

宫颈鳞癌组织中AEG-1蛋白表达显著高于正常宫颈组织，且差异有统计学意义(P<0.05)。与正常宫颈组织相比，3株宫颈癌细胞系中AEG-1蛋白表达均显著上调(P<0.05)。在所有检测的组织和细胞中，SiHa细胞中AEG-1蛋白表达显著高于其它各组(P<0.05)，见图1。

Figure 1. Expression of AEG-1 protein in cervical carcinoma tissues and cells.N: normal cervical tissues; T:cervical squamous cell carcinoma tissues.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsN;#P<0.05vsother groups.

图1AEG-1蛋白在宫颈鳞癌组织和细胞中的表达

2AEG-1siRNA下调宫颈癌SiHa细胞中AEG-1蛋白的表达

AEG-1 siRNA组中AEG-1蛋白表达显著低于未处理组和对照siRNA组，差异显著(P<0.05)。未处理组和对照siRNA组之间AEG-1蛋白表达无显著差异(P>0.05)，见图2。

3AEG-1表达下调对宫颈癌SiHa细胞周期的影响

AEG-1 siRNA组中SiHa细胞在G0/G1期细胞的比例(59.23%±1.05%)显著高于未处理组(42.88%±1.33%)和对照siRNA组(43.13%±0.88%)(P<0.01)。AEG-1 siRNA组中SiHa细胞在S期的比例(26.46%±0.87%)显著低于未处理组(32.59%±1.19%)和对照siRNA组(31.83%±1.11%)(P<0.01),见表1。

4AEG-1表达下调抑制宫颈癌SiHa细胞的侵袭能力

AEG-1 siRNA组中SiHa细胞的穿膜数(43.45±4.22)显著低于未处理组(113.34±5.15)和对照siRNA组(109.26±4.05)(P<0.01)，而未处理组和对照siRNA组之间SiHa细胞的穿膜数无显著差异(P>0.05)。

Figure 2. Expression of AEG-1 protein in cervical carcinoma SiHa cells after transfection with AEG-1 siRNA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnon-treatment or control siRNA.

图2转染AEG-1siRNA后宫颈癌SiHa细胞AEG-1蛋白的表达

表1AEG-1表达下调对宫颈癌SiHa细胞周期的影响

Table 1. Effect of down-regulation of AEG-1 expression on cell cycle of cervical carcinoma SiHa cells (%.Mean±SD.n=3)

GroupG0/G1SG2/MNon-treatment42.88±1.3332.59±1.1924.53±0.31ControlsiRNA43.13±0.8831.83±1.1125.03±0.68AEG-1siRNA59.23±1.05**26.46±0.87**14.30±0.46**

**P<0.01vscontrol siRNA.

5Westernblotting检测cyclinD1、CDK2和MMP-9的表达

AEG-1 siRNA组中cyclin D1、CDK2和MMP-9蛋白的表达均显著低于未处理组和对照siRNA组(P<0.05)，而未处理组和对照siRNA组之间cyclin D1、CDK2和MMP-9蛋白的表达无显著差异(P>0.05)，见图3。

讨 论

近几年来，AEG-1在肿瘤中的作用日益成为广大科研工作者关注的对象，可能成为肿瘤潜在的预后指标和分子靶点[9]。研究显示，AEG-1牵涉肿瘤发展过程中的多种细胞生物学过程，包括：细胞存活、血管生成、侵袭、转移、凋亡和化疗抗性[4, 10-12]。最初对于AEG-1与肿瘤关系的研究集中在乳腺癌、神经胶质瘤和前列腺癌中[6, 11, 13]。在乳腺癌中，AEG-1的表达水平与乳腺癌的临床阶段和TNM分期密切相关，可能是乳腺癌潜在的预后指标[6]。通过拷贝数的变化和基因表达相关性分析，AEG-1已经被鉴定作为转移相关基因，其过表达有助于乳腺癌中的基因组扩增[14]。在食管鳞癌、非小细胞肺癌和肝癌的研究中发现AEG-1水平上调与病人的临床分期和较差的预后相关[3-5]，因而进一步提示AEG-1可能在不同类型的肿瘤中作为癌基因而发挥其相应的生物学功能。在本研究中，我们检测了正常宫颈组织、宫颈鳞癌组织和3株宫颈癌细胞中AEG-1蛋白的表达，发现宫颈鳞癌组织中AEG-1蛋白的表达显著高于正常宫颈组织，并且3株宫颈癌细胞中AEG-1蛋白的水平也明显高于正常宫颈组织，提示AEG-1可能在宫颈鳞癌的发生发展过程中发挥重要的作用，但其确切的分子机制和表达模式尚需进一步探讨。

Figure 3. Down-regulation of AEG-1 expression inhibited the expression of cyclin D1, CDK2 and MMP-9 proteins in cervical carcinoma SiHa cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnon-treatment or control siRNA.

图3AEG-1表达下调抑制宫颈癌SiHa细胞中cyclinD1、CDK2和MMP-9的表达

许多研究支持AEG-1通过激活增殖途径和抗凋亡效应促进肿瘤细胞的增殖[11, 15]。在前列腺癌和乳腺癌中的研究表明，AEG-1表达上调与细胞周期抑制子表达的下调密切相关，从而导致细胞增殖加速[11, 15]。此外，Liu等[16-17]研究证实，在神经母细胞瘤中，AEG-1表达下调能诱导细胞周期静止在G0/G1期，从而抑制肿瘤的增殖。为了进一步分析AEG-1在宫颈癌中的功能，我们选择AEG-1表达量最高的SiHa细胞作为研究对象，利用AEG-1 siRNA转染SiHa细胞，结果表明AEG-1 siRNA转染后48 h，AEG-1蛋白表达显著下调，这为进一步研究AEG-1在宫颈癌中的功能提供理想的研究平台。进一步我们采用流式细胞术分析转染前后SiHa细胞周期分布的变化，我们发现AEG-1 siRNA组中SiHa细胞在G0/G1期的比率显著高于未处理组和对照siRNA组，而S期的比率显著高于未处理组和对照siRNA组，提示AEG-1表达下调通过静止细胞周期在G0/G1期，从而抑制宫颈癌细胞的增殖。进一步我们分析与细胞周期密切相关的cyclin D1和cdk2蛋白的表达，AEG-1 siRNA转染后cyclin D1和cdk2蛋白的表达均显著下调，这一结果提示AEG-1介导的宫颈癌细胞周期静止可能与细胞周期相关蛋白cyclin D1和cdk2表达下调密切相关。

对于AEG-1对肿瘤细胞的生物学功能和恶性表型的影响已经成为肿瘤生物学领域研究的热点，最初的证据表明AEG-1过表达有助于乳腺癌细胞向肺转移[2]，这一点进一步被后来的体内实验所证实[14]。此外，AEG-1被证实能促进肿瘤的侵袭和转移，Liu等[18]研究表明，AEG-1促进神经胶质瘤细胞的侵袭。为了探讨AEG-1与宫颈癌细胞侵袭的关系，我们采用Boyden小室检测了转染AEG-1 siRNA前后宫颈癌SiHa细胞侵袭能力的变化，结果显示AEG-1 siRNA组中宫颈癌SiHa细胞穿膜数显著低于未处理组和对照siRNA组，提示AEG-1表达下调能显著降低宫颈癌细胞的侵袭能力。众所周知，MMP-9是一种广泛被研究的基质金属蛋白酶家族的成员之一，是肿瘤侵袭和转移过程中侵袭细胞的ECM降解和细胞因子活化所必需的因子[19]。研究发现AEG-1能直接靶向和反式激活MMP-9基因的启动子，从而抑制肿瘤的侵袭能力[18]。基于此，我们也在宫颈癌细胞中检测转染AEG-1 siRNA前后MMP-9蛋白的表达，结果发现AEG-1表达下调能明显引起MMP-9的下调，但其在宫颈癌中确切的分子作用机制尚需要进一步探讨，但我们的结果可以初步表明AEG-1表达下调介导的侵袭能力降低可能与MMP-9蛋白表达下调密切相关。

总之，我们这里呈现的结果显示，AEG-1表达下调能显著静止宫颈癌细胞周期和降低宫颈癌细胞侵袭能力，这可能与cyclin D1、CDK2和MMP-9表达下调密切相关，后续进一步研究AEG-1在宫颈癌发生发展中的分子机制有望为宫颈癌的分子靶向治疗提供新的实验依据。

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Effectsofdown-regulationofAEG-1expressiononcellcycleandinvasionofhumancervicalcarcinomacells

QIN Rui-ying1, XIA Yong-hua2, REN Yan-fang1, PAN Ying3, YANG Jun1, WANG Hui-ling1, WANG Yu-hong1

(1DepartmentofObstetrics&Gynecology,2DepartmentofDermatology,TheFirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453100,China;3DepartmentofObstetricsandGynecology,TheThirdAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China.E-mail:qinruiying666@163.com)

AIM: To investigate the effects of down-regulation of astrocyte elevated gene-1 (AEG-1) expression on cell cycle and invasion of human cervical carcinoma SiHa cells.METHODSThe protein expression of AEG-1 was detected by Western blotting in normal cervical tissues, cervical squamous cell carcinoma tissues, HeLa cells, SiHa cells and CaSki cells. Control siRNA or AEG-1 siRNA was transfected into SiHa cells, and the protein expression of AEG-1 in SiHa cells was detected by Western blotting. The changes of cell cycle distribution and cell invasion were determined by flow cytometry and Boyden chamber, respectively. The protein levels of cyclin D1, cyclin-dependent kinase 2(CDK2) and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) were analyzed by Western blotting.RESULTSThe protein expression of AEG-1 in cervical squamous cell carcinoma tissues was significantly higher than that in normal cervical tissues (P<0.05). Meanwhile, the protein expression of AEG-1 in the 3 cervical carcinoma cell lines was obviously higher than that in normal cervical tissues, in which SiHa cells displayed the highest AEG-1 protein level (P<0.05). In addition, AEG-1 siRNA effectively down-regulated the protein expression of AEG-1 in SiHa cells, which led to increase the percentage at G0/G1phase and reduced the invasion of SiHa cells. Furthermore, the protein levels of cyclin D1, CDK2 and MMP-9 in AEG-1 siRNA group were markedly lower than those in non-treatment group and control siRNA group (P<0.05).CONCLUSIONOver-expression of AEG-1 may be closely associated with the occurrence and development of cervical carcinoma, and the AEG-1 down-regulation-mediated cell cycle arrest and attenuation of invasion may be tightly related to the down-regulations of cyclin D1, CDK2 and MMP-9 at protein levels.

Astrocyte elevated gene-1; Uterine cervical neoplasms; Small interfering RNA; Cell cycle; Neoplasm invasiveness

R737.33

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.011

1000- 4718(2013)06- 1020- 05

2012- 12- 03

2013- 03- 26

河南省卫生厅科技攻关项目(No. 200802009)； 河南省教育厅自然科学研究计划项目(No. 2008A320011)

△通讯作者 Tel: 0373-4404665; E-mail: qinruiying666@163.com