MALT1基因2种转录本在正常人和B细胞白血病患者中的表达特点

王 旭， 张 帆， 徐 艳， 吴秀丽， 陈少华， 杨力建， 李 萡， 卢育洪， 李扬秋,△

(暨南大学 1再生医学教育部重点实验室， 2医学院血液病研究所，3第一附属医院血液科, 广东 广州 510632)

MALT1基因2种转录本在正常人和B细胞白血病患者中的表达特点

王 旭1， 张 帆2， 徐 艳1， 吴秀丽2， 陈少华2， 杨力建2， 李 萡2， 卢育洪3， 李扬秋1,2△

(暨南大学1再生医学教育部重点实验室，2医学院血液病研究所，3第一附属医院血液科, 广东 广州 510632)

目的比较正常人和B细胞白血病患者外周血中黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤转位基因1(MALT1)2种异构体的分布和表达差异。方法根据MALT1基因的结构特点，设计2对引物，通过建立2种转录本的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法分析8例B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、8例B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)和8例正常人的外周血单个核细胞(PBMC)中MALT1的表达情况。实时定量PCR分析各组样本的MALT1 mRNA表达水平。结果所有样本中均能得到所预期的PCR产物，其中第1对引物可以扩增出2条片段，分别为MALT1转录本1(包含第5、6、7、8、9外显子)和MALT1转录本2(包含第5、6、8、9外显子)，第2对引物只能扩增出1条包含转录本1的片段，所有PCR产物均通过核苷酸序列分析证实。MALT1 2种转录本均在外周血中有表达，并且MALT1转录本2表达水平高于转录本1。通过灰度分析发现，在B-ALL中，MALT1转录本1的灰度与正常人相比显著增高(P<0.05)，而MALT1转录本2显著降低(P<0.05)；在B-CLL中，MALT1 2种转录本的灰度与正常人相比无显著差异(P>0.05)。此外，B-ALL中，MALT1 mRNA表达水平(中位数：1.253)低于正常人(中位数：1.976)(P=0.05)；而B-CLL中，MALT1 mRNA的表达水平与正常人相比无显著差异(P>0.05)。结论MALT1 2种转录本均表达于正常和B细胞白血病样本中，但B-ALL中两者的表达水平有所差异，同时，B-ALL的MALT1 mRNA表达水平也有所降低。B-ALL中MALT1基因表达的异常可能影响MALT1信号通路而与疾病的发生发展相关。

黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤转位基因1； 转录本； 白血病，B细胞； 基因表达

黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤转位蛋白1 (mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation protein 1, MALT1) 是核因子κB (nuclear factor κB, NF-κB)信号通路中的一种调控蛋白，其功能：(1)作为支架蛋白促进依赖于IKK的NF-κB的活化；(2)类似于细胞凋亡蛋白酶 (caspase) 的蛋白，水解一些NF-κB相关因子，故MALT1又被称为paracaspase[1-2]。MALT1在T细胞受体介导的NF-κB活化和调控淋巴细胞增殖和分化的过程中具有重要作用[3-4]。根据基因库资料显示MALT1基因存在2种转录本，但这2种转录本在正常人和血液肿瘤中的分布特点尚未见报道。本研究首先分析MALT1 2种转录本在正常人和B细胞白血病中的分布和表达特点，期望为以MALT1为靶点治疗B细胞白血病的研究提供依据。

材 料 和 方 法

1样本

收集正常人、B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-cell chronic lymphocytic leukemia,B-CLL)和B细胞急性淋巴细胞白血病(B-cell acute lymphocytic leukemia,B-ALL)患者外周血样本各8例，利用淋巴细胞分离液(Ficoll)分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。Toledo(弥漫大B细胞淋巴瘤B细胞)、EJ-1(弥漫大B细胞淋巴瘤B细胞)、Jurkat(淋巴细胞瘤T细胞)、Motl4(急性淋巴母细胞白血病T细胞)、K562(慢性髓性白血病细胞)和HL-60(急性粒细胞白血病细胞)细胞株作为对照。

2主要方法

2.1RNA提取和cDNA合成 应用RNAzol试剂盒提取RNA 并应用随机引物和反转录酶试剂盒反转录合成cDNA 第1链, 均按常规方法进行。合成cDNA 经过β2-微球蛋白(β2-microglobulin,β2M)的RT-PCR鉴定合成质量。

2.2设计并合成PCR引物 根据基因库报道的人类MALT1基因(Accession No. NM006785, NM173844)2种转录本的序列特点设计引物(表1), 引物由上海英骏生物技术有限公司合成。转录本2比转录本1缺少33个碱基，包含MALT1转录本1第6个外显子的最后1个碱基，第7个外显子和第8个外显子的第1个碱基(图1)。第1对引物分别位于第5和第9外显子上，即能确定扩增出2个相差33 bp的片段，MALT1转录本1和MALT1转录本2；而第2对引物的上游引物与第1对引物上游引物相同，下游引物位于第7外显子上(转录本2缺失的区域内)，仅能扩增出MALT1转录本1的基因片段。

表1 用于RT-PCR检测的MALT1基因引物序列

Figure 1. Diagrams of the 2MALT1 transcript variants and the sequencing results. A: the diagram ofMALT1 transcript variant 1；B: the diagram ofMALT1 transcript variant 2; C：the sequencing result of part ofMALT1 transcript variant, arrows showing the segment deleted inMALT1 transcript variant 2 (33 bp); D: the sequencing result of part ofMALT1 transcript variant.

图1MALT1基因2种转录本示意图和测序结果

2.3RT-PCR 总反应体系为20 μL，含1 μL cDNA模板、1.25 U Taq聚合酶、0.1 mmol/L dNTP、4 μL 5× PCR 缓冲液、1.5 mmol/L MgCl2和0.5 μmol/L的上、下游引物(同时检测2种转录本所采用引物为MALT1-1F和MALT1-1R，即引物对MALT1-1;而检测转录本1所采用引物为MALT1-1F和MALT1-2R,即引物对MALT1-2)。反应在PCR 扩增仪中进行。反应分别设阳性对照、阴性对照及样品组。反应条件: 94 ℃ 30 s (首次10 min)，59 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，末次10 min, 共35个循环。PCR产物于3%琼脂糖凝胶中进行电泳并分析结果[5]。

2.4核苷酸测序 随机选取引物扩增的PCR 产物各1份进行核苷酸序列分析。具体操作: 20 μL PCR产物置于3%琼脂糖凝胶中进行电泳, 引物对MALT1-2 PCR产物只有1条带，而引物对MALT1-1的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳得到2个产物，分别收集2产物条带的琼脂糖凝胶。将产物置于干净的离心管中，普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物并纯化, 纯化的产物送上海英骏生物技术有限公司测序[6]。

2.5实时定量RT-PCR 利用SYBR GreenⅠ染料进行各基因的实时荧光定量PCR检测，扩增总反应体系为20 μL,应用Real Master Mix试剂盒(Tiangen，北京)，其中包括2× Real Master Mix 9 μL、 10 mmol/L上、下游引物0.5 μL以及1 μL cDNA等。每一标本均设复孔，每一基因均设阴性对照孔。反应条件为95 ℃预变性15 min后，共进行45个循环扩增，每一循环包括95 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s。随后,以0.17 ℃/s变化速度从55 ℃到95 ℃每隔2 s记录1次荧光值,获得熔解曲线。反应在CFX96荧光定量PCR仪(Bio-Rad)中进行[7]。

2.6MALT1 mRNA表达水平的计算方法 采用相对定量法分别分析B-ALL患者、B-CLL患者和正常人PBMC中MALT1 mRNA表达水平的差异，以β2M为内参照。计算公式[8]为：相对mRNA表达量=2-ΔCt×100%，其中，ΔCt=Ct(MALT1)-Ct(β2M)。

2.7灰度分析 应用凝胶成像分析软件Gel-Pro Analyzer 4(Media Cybernetics)对正常人、B-ALL和B-CLL 3份凝胶图像进行灰度分析，得出MALT1转录本1和MALT1转录本2所占的灰度比。

3统计学处理

利用SPSS 17.0软件进行统计学分析。数据以中位数表示，组间比较均采用秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

利用本实验所设计针对MALT1 2种转录本检测的3个引物，分别检测同时含有2种MALT1转录本(图2A)和仅含MALT1转录本1(图2B)的PCR产物。所扩增出PCR产物与预期产物片段大小相一致。图2A可见扩增出2条不同大小的片段分别为MALT1的2种转录本，224 bp和191 bp;而图2B则可见所扩增的PCR产物为单一的MALT1转录本1基因片段，大小为195 bp。分别将凝胶电泳中所见的2种不同大小的PCR产物分离、纯化和进行序列分析，证明其核苷酸序列与2种转录本的序列相同，见图1C、D。

Figure 2. The expression of the 2MALT1 transcript variants in different hematologic malignancy cell lines.A:PCR products amplified by MALT1-1F and MALT1-1R primers; B: PCR products amplified by MALT1-1F and MALT1-2R primers. M: DNA marker; 1： Toledo; 2： EJ-1; 3： Jurkat; 4： Motl4; 5： K562; 6： HL-60; 7, 8： healthy individuals.

图2MALT12种转录本在不同血液肿瘤细胞株中的表达

进一步比较正常人、B-ALL患者和B-CLL患者样本中MALT1 2种转录本的表达情况，结果显示，所有样本均表达2种转录本，在正常人和B细胞白血病患者的大多数样本中MALT1转录本2比转录本1表达量要高，见图3。在所检测的6种细胞株(Toledo、EJ-1、Jurkat 4、Motl4、K562和HL-60)中，2种转录本表达水平差别不大，见图2A。

Figure 3. The expression of the 2MALT1 transcript variants in PBMC from healthy individuals (A), B-CLL patients (B) and B-ALL patients (C). M: DNA marker.

图3MALT12种转录本在B-ALL患者、B-CLL患者和正常人PBMC中的表达

对B-ALL和B-CLL 患者2种转录本的凝胶成像进行灰度分析，并分别与正常人进行秩和检验发现，B-ALL患者中MALT1转录本1的灰度比(中位数为13.3725)与正常人(中位数为7.205)相比显著增高(P<0.05)，MALT1转录本2的灰度比(中位数为86.626)与正常人(中位数为92.795)相比显著降低(P<0.05)；B-CLL患者中MALT1 2种转录本的灰度比(中位数分别为6.765和93.235)与正常人(中位数分别为7.205和92.795)相比差异无统计学意义(P>0.05)；而B-ALL患者中的MALT1转录本1的灰度比(中位数为13.372)较B-CLL(中位数为6.765)有明显增高(P<0.05)，MALT1转录本2的灰度比(中位数为86.628)较B-CLL(中位数为93.235)有明显降低(P<0.05)。

对MALT1 mRNA表达量的定量PCR结果进行秩和检验发现，在B-ALL患者中MALT1 mRNA的表达量(中位数为1.253)较正常人(中位数为1.976)降低(P=0.05)；在B-CLL患者中，MALT1 mRNA表达量(中位数为3.560)与正常人(中位数为1.976)相比差异没有统计学意义(P>0.05)；而B-ALL MALT1 mRNA表达量较B-CLL差异有统计学意义(P<0.05)。

Figure 4. Relative expression level of MALT1 mRNA in PBMC from B-ALL patients,B-CLL patients and healthy individuals. ·2: outlier.

图4B-ALL患者、B-CLL患者与正常人中MALT1mRNA的相对表达水平

讨 论

在淋巴细胞中，MALT1与B细胞淋巴瘤10 (B-cell lymphoma/leukemia 10, Bcl-10)和含caspase募集结构域的膜相关鸟苷酸激酶1 [caspase-recruitment domain (CARD)-containing membrane-associated guanylate kinase protein 1, CARMA1] 结合形成CBM复合物，活化NF-κB,对于调控淋巴细胞的增殖和分化有着重要的作用。故MALT1 mRNA或蛋白的异常表达，可造成NF-κB的持续性表达[2,9]，是一些淋巴瘤发病的主要原因[10]。

MALT1基因位于染色体18q21区域，全长78 753 bp，含有位于N端的死亡结构域、与其紧连的2个免疫球蛋白样结构域和C端的caspase样结构域[10]。基因库资料显示人类MALT1存在2种转录本。但并没有详细文献报道2种转录本在正常人和不同疾病患者中表达的差异性，为了进一步研究MALT1在淋巴细胞肿瘤中的作用特点，本研究首先比较分析正常人与B细胞白血病患者中MALT1转录本分布差异特点。MALT1转录本2相较于转录本1缺少第7个外显子、第6外显子的最后1个和第8外显子第1个碱基。根据这个基因结构上的特点，本研究通过设计可同时扩增2种转录本的引物和定点在转录本2缺失区域的引物，后者只能扩增转录本1这一种产物，PCR和核苷酸序列分析实验结果证明了与预期设计完全相同。

从电泳结果中我们发现，B-ALL患者、B-CLL患者和正常人外周血中都表达MALT1的2种转录本，并且转录本2比转录本1表达量高，两者之间表达量相差较大。经过灰度分析和统计学分析发现在B-ALL中，MALT1转录本1灰度比正常人要高。B-ALL中MALT1转录本1相对高表达的特点是否与B-ALL发生发展有着一定的相关性，有待进一步研究。有趣的是，定量分析则发现MALT1 mRNA(包括2种转录本)的表达水平低于正常人，该结果与既往发现的MALT1高表达在黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤发生中具有重要作用的结果有所不同[4]，这可能由于MALT1调控细胞的增殖和分化是通过与Bcl-10结合激活NF-κB来实现的，单独的MALT1并没有激活NF-κB的能力。有报道认为，MALT1的缺失对NF-κB的活化影响不大[10-11]，因此，MALT1的低表达可能不是介导B-ALL发生的主要因素。其次，MALT1是肿瘤抑制因子A20的降解介导分子，后者拥有抗凋亡和抑制肿瘤的双重功能，而MALT1的低表达，可能有助于A20发挥抗凋亡作用而在B-ALL的发生中起到相应的作用[12-15]。然而，这些推测还有待进一步验证。本研究发现B-CLL患者MALT1的2种转录本分布和表达水平与正常对照组没有明显差异，提示MALT1可能与B-CLL细胞相关信号通路表达变化关系不大。而对B-ALL和B-CLL患者 2种转录本的分布和表达水平的分析发现，两方面都存在明显的统计学差异，值得进一步比较B-ALL与B-CLL之间的差异，以期发现其可能的新分子机制。此外，我们在多个不同的白血病细胞株中发现MALT1 2种转录本的表达水平很接近，与我们检测样本有很大的不同，这一结果值得我们进一步研究不同白血病中MALT1转录本1的高表达特点和意义。

总之，本研究建立了检测2种MALT1转录本的方法，并首先报道了其在正常人和B细胞白血病之间分布和表达的差异特点，这些结果有助于深入探讨MALT1在B-ALL细胞中的作用特点。进一步构建MALT1基因转录本的表达载体，分析其功能差异将是一项有意义的工作。

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TranscriptsofMALT1geneinhealthyindividualsandB-cellleukemiapatients

WANG Xu1, ZHANG Fan2, XU Yan1, WU Xiu-li2, CHEN Shao-hua2, YANG Li-jian2, LI Bo2, LU Yu-hong3, LI Yang-qiu1,2

(1KeyLaboratoryforRegenerativeMedicineofMinistryofEducation,2InstituteofHematology,SchoolofMedicine,3DepartmentofHaematology,theFirstAffiliatedHospital,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:jnyangqiuli@163.com)

AIM: To investigate the difference of the distribution and expression of mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation gene 1(MALT1) transcripts in healthy individuals and B-cell leukemia patients.METHODSTwo pairs of primers were designed according to the sequences of differentMALT1 transcripts. RT-PCR was performed to detect the distribution ofMALT1 gene in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from 8 healthy individuals, 8 patients with B-cell acute lymphocytic leukemia (B-ALL) and 8 patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL). The mRNA expression of MALT1 in all samples from the 3 groups was determined by real-time PCR.RESULTSExpected amplicons were amplified by the 2 primer pairs, and 2 PCR products of different sizes were amplified by the first primer pair (the larger one included exons 5, 6, 7, 8 and 9, and the small one included exons 5, 6, 8 and 9). Moreover, theMALT1 transcript variant 1 was conformed by the second primer pair. All the PCR products were confirmed by the nucleotide sequencing analysis. Two transcripts ofMALT1 were identified in all samples from both healthy individuals and B-cell leukemia patients, and the expression level ofMALT1 was predominant in transcript variant 2. The gray level ofMALT1 transcript variant 1 in B-ALL patients was significantly higher than that in healthy individuals, whereas theMALT1 transcript variant 2 was significantly lower than that in healthy group. However, no significant difference of the gray level was found in the 2MALT1 transcript variants in B-CLL group as compared with healthy group. In addition, the expression level of MALT1 mRNA in B-ALL group (median=1.253) was lower than that in healthy group (median=1.976,P=0.05), while no significant difference of the expression level of MALT1 mRNA between B-CLL patients and healthy individuals was found.CONCLUSIONTwo transcripts ofMALT1 have common distribution in both healthy individuals and B-cell leukemia patients, while the significant differences of distribution ofMALT1 transcript variants and the expression level of MALT1 mRNA are characterized in B-ALL patients. The abnormal expression ofMALT1 gene might involve in the genesis and development of leukemia via MALT1 signaling pathway.

Mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation gene 1; Transcript variants; Leukemia, B-cell; Gene expression

R329.21

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.028

1000- 4718(2013)06- 1124- 06

2012- 12- 12

2013- 04- 24

国家自然科学基金资助项目(No.91129720);广东省科技计划(国际合作)项目(No.2012B050600023)

△通讯作者 Tel: 020-85226877; E-mail: jnyangqiuli@163.com