密蒙花麦角甾苷锥形柱分离工艺优化

胡 海，张红菱，陈 新，杨 桃，万育红

(武汉工业学院生物与制药工程学院，湖北武汉 430023)

密蒙花又称蒙花、羊耳朵、虫见死草等，为马钱科醉鱼草属植物Buddleja off cinalis Maxim.的干燥花蕾及花序［1］。《中国植物志》记载其分布于陕西、甘肃、西南、中南等地。山坡、杂木林地、河边和丘陵常见。花供药用，可清肝明目，退翳，止咳［2］。主要用于目赤肿痛，多泪羞明，眼生翳膜，肝虚目暗，视物昏花。麦角甾苷(Acteoside)是密蒙花的主要活性成分之一［3－4］。具有抗衰老，抗病毒，抗菌，免疫抑制，抗癌，抗炎等药理作用［5］。本文以本实验室分离、纯化所得的麦角甾苷(纯度为95%以上)为对照品，进行密蒙花麦角甾苷含量测定和分析检测方法研究［6－7］，在此基础上采用正交试验进行密蒙花麦角甾苷的分离工艺研究。

马继平［8］等研究表明，锥形柱比相同体积、相同长度的圆柱形柱有更高的分离柱效和更大的样品容量。本文采用锥形柱对密蒙花麦角甾苷进行分离，通过考察分离柱角度，硅胶用量，洗脱流速等影响密蒙花麦角甾苷分离效率的因素，确定最优分离工艺，为密蒙花麦角甾苷工业化快速分离提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

DIONEX高效液相色谱仪(备有单元泵、自动进样器以及UVD170U检测器):美国戴安公司;SB－5200双频超声清洗机:宁波新芝生物科技有限公司;BUCHI旋转蒸发仪;瑞士 BUCHI公司;予华SHZ—D(1Q)循环水式真空泵:巩义市予华仪器厂。

1.2 试验材料

麦角甾苷对照品(南京泽朗医药科技有限公司)，乙睛(色谱纯，科密欧公司)，试验用水为Aquapro超纯水，其他试剂为分析纯。密蒙花购于安徽亳州中药材批发市场。5°砂芯层析柱(入口径30mm出口径10mm长度25cm)，15°砂芯层析柱(入口径45mm出口径15mm长度25cm)，45°砂芯层析柱(入口径65 mm 出口径10 mm 长度25 cm)，90°砂芯层析柱(内径25 mm长度25 cm)。

1.3 实验方法

1.3.1 密蒙花麦角甾苷样品制备

将密蒙花在温度60℃的条件下用60%乙醇溶液回流提取，密蒙花与乙醇溶液体积比为1∶10，共提取3次，每次提取时间2 h，合并提取液，浓缩得到粗提浸膏。粗提浸膏过层析柱得到试验用麦角甾苷样品。实验时，取一定量麦角甾苷样品过层析柱。

1.3.2 麦角甾苷测定方法

取麦角甾苷样品/标准品用甲醇溶解并定容至10 mL的容量瓶中，HPLC法测定麦角甾苷的峰面积，根据标准曲线计算麦角甾苷纯度。

麦角甾苷样品回收率(%)=C×稀释倍数×V/m;式中:C为样品中麦角甾苷质量浓度(mg/mL);稀释倍数为50;V为原液体积50 mL;m为样品质量(g)。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的绘制

2.1.1 HPLC 检测条件的选择

GRACE C18(250×4.6 mm)色谱柱，流动相为乙睛∶水∶甲酸(18∶81∶1)，紫外检测波长为334 nm，柱温30℃，流速为1mL/min，检测时间为 30 min［7］。

2.1.2 麦角甾苷标准溶液的配制和线性关系考察

精确称取麦角甾苷对照品7.5 mg，用60%乙醇溶解，定容于25 mL容量瓶中，得质量浓度为0.20 mg/mL的标准溶液。依次取 5 mL，2.5 mL，1.25 mL，0.625 mL，0.313 mL 的对照品溶液用甲醇定容至10 mL 的容量瓶中，配制成 150 μg/mL，75 μg/mL，37.5 μg/mL，18.75 μg/mL，9.375 μg/mL 对照品溶液。绘制标准曲线，以标准品浓度为纵坐标，峰面积为横坐标，得标准曲线Y=1.323 4 X－3.169 7。在9.375 μg/mL—150 μg/mL 范围内线性关系良好。标准曲线见图1。

图1 麦角甾苷样品标准曲线

2.2 单因素实验

2.2.1 分离柱角度对分离效果的影响

将洗脱流速控制在18 ml/min，硅胶∶样品的质量比为 75∶1，在此实验条件下，分别选用5°，15°，45°，90°层析柱，进行单因素实验，测得其平均纯度为88%，回收率见图2。

图2 层析柱角度对麦角甾苷回收率的影响

实验结果表明，在其他实验条件不变的情况下，选用15°层析柱分离时麦角甾苷回收率较高，选用5°，45°，90°层析柱麦角甾苷回收率相对较低。

2.2.2 硅胶用量对分离效果的影响

将洗脱流速控制在18 ml/min，选用15°层析柱分离，在此实验条件下，分别以硅胶∶样品的质量比为40∶1，50∶1，75∶1，100∶1，进行单因素实验，测得其平均纯度为88%，回收率见图3。

图3 硅胶与样品的质量比对麦角甾苷回收率的影响

实验结果表明，在其他实验条件不变的情况下，硅胶∶样品的质量比为40∶1，50∶1，75∶1时麦角甾苷回收率随着硅胶:样品的质量比的增大而增大，硅胶∶样品的质量比为75∶1时麦角甾苷回收率达到最大.但硅胶∶样品的质量比为100∶1时，麦角甾苷回收率减小，分析原因可能是硅胶过量导致分离过程样品的死吸附量增大。

2.2.3 洗脱流速对分离效果的影响

将硅胶∶样品的质量比控制为75∶1，选用15°层析柱分离。在此实验条件下，分别一流速为12 mL/min，18 mL/min，24 mL/min，30 mL/min 条件下洗脱，测得其平均纯度为88%，回收率见图4。

图4 洗脱流速/对麦角甾苷回收率的影响

实验结果表明，洗脱流速为30 mL/min，24 mL/min，18 mL/min，时麦角甾苷回收率与洗脱流速成负相关。洗脱流速为18 mL/min时麦角甾苷回收率最大。随着洗脱速度的增大，回收率降低，可能原因是流速过快导致洗脱剂与样品不能充分接触洗脱。

2.3 麦角甾苷分离最佳条件的确定

在单因素实验的基础上选定层析柱类型，硅胶用量，洗脱流速三因素为考察指标，按L9(34)正交表三因素三水平进行正交实验，从中筛选最佳的分离条件见表1，结果见表2。如表2所示，正交试验结果表明分离柱角度对实验结果的影响显著，其次为硅胶用量。影响实验结果的显著性因素依次为分离柱角度(A)＞硅胶用量(B)＞洗脱流速(C)。优化后的分离工艺为A2B3C1。即选用15°层析柱，硅胶∶样品的质量比为75∶1，洗脱流速为18 mL/min。在此条件下，麦角甾苷回收率最大。为验证理论预测值，在最优条件A2B3C1下进行验证试验。重复实验3次，测得平均回收率为85.9%。说明优化的方案可行。

表1 正交试验因素水平表

表2 正交试脸结果及分析

2.4 锥型柱分离与圆柱形柱分离的比较

在硅胶∶样品的质量比为75∶1，洗脱流速为18 mL/min的实验条件下，用圆柱形柱分离一定量的麦角甾苷样品，测得回收率只有79.8%，而选用15°层析柱分离时麦角甾苷回收率可达86.0%，效果显著提高。实验结果表明，锥形柱分离效果明显优于圆柱形柱。

3 结论

由于锥型柱入口处横截面积较大，可以使样品平铺均匀，且分离等量样品时，与常规柱形相比，由于横截面积大，样品上样厚度减小，相对柱高而言，其分离的理论踏板数增大。此外，锥型柱为横截面直径逐渐减小的锥形结构，此结构可以相对避免分离柱出口陡然减小时造成流路死角，从而减小柱外效应［8］。选用锥形柱分离密蒙花麦角甾苷，柱效明显高于圆柱型柱。

由正交实验结果可知，对密蒙花麦角甾苷的分离影响最大的因素是分离柱的柱型，其次是硅胶用量。优化后的密蒙花麦角甾苷锥形柱分离条件为15°层析柱，硅胶∶样品的质量比为75∶1，洗脱流速为18 mL/min。此条件下密蒙花麦角甾苷回收率达到85.9%。麦角甾苷的纯度可达85%以上。

［1］国家药典委员会.中国药典(二部)［M］.北京:化学工业出版社，2005:230.

［2］中国科学院植物志编辑委员会.中国植物志［M］.北京:科学出版社，1992:277.

［3］韩澎，崔亚君，郭洪祝，果德安.密蒙花化学成分及其活性研究［J］.中草药.2004，35(10):1086－1090.

［4］LI Jiao－she，ZHAO Yu－ying，MA Li－bin.A new phenylethanoid glucoside from Buddleia Officinalis Maxim ［J］. J Chin pharm Sci，1997，6(4):178.

［5］崔颖，张永旺.密蒙花研究进展［J］甘肃中医学院学报.2010，27(2):65 －68.

［6］戴树培，曾嘉明，李教社，等.密蒙花有效成分提取及含量测定方法［J］.西北药学杂志.1996，11(5):204 －205.

［7］韩澎，崔亚君，郭洪祝，等.中药密蒙花药材RP－HPLC指纹图谱研究［J］.中国中药杂志.2004，29(10):938 －940.

［8］马继平，陈令新，朱道乾，等.筛板对台锥形制备液相色谱柱流型和柱效的影响［J］.色谱.2003，21(4):430 －433.