莲藕的组织培养研究

陈江山，胡 臣，冯陈龙，李 佳

(武汉工业学院生物与制药工程学院，湖北武汉 430023)

莲藕(Nelumba nucifera)系睡莲科(Nymphaeaceae)莲属(Nelumbo)多年生大型水生草本植物，在我国分布及栽培极为广泛，以湖北、江苏、安徽等省种植面积最大，是我国重要的水生蔬菜之一。莲藕营养丰富，含淀粉、蛋白质、钙、铁及多种维生素等，具有很高的营养价值。此外其果实、种子、花、叶、地下茎各部分均为重要的传统中药材［1］。目前，我国莲藕栽培大多采用种藕繁殖，其繁殖系数较低(1∶10)［2-3］，且容易积累病菌，影响生长，甚至品种退化［4］。而采用组织培养技术［5-6］可有效除菌，提高莲藕的繁殖系数。本文通过对莲藕顶芽及侧芽外植体的直接诱导方式获得了不定芽［7］，为大规模快速繁殖莲藕植株及进一步的研究奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

供试莲藕品种为鄂莲五号“3735”［8］，由湖北省武汉市东西湖区吴家山西湖大队提供。于3—4月间栽种期，取藕头饱满、顶芽完整的种藕为试材。

1.2 方法

1.2.1 材料处理

选取顶芽与侧芽，将其外部叶片剥去，在自来水下冲洗干净，然后在无菌条件下用75%的酒精消毒30 s，随即放入0.1%升汞溶液中处理15 min，用无菌水漂洗4次，纵切成0.3—0.5 cm3的外植体，接种到培养基上进行培养。

1.2.2 培养基

(1)不定芽诱导培养基。以MS为基本培养基，附加不同浓度的 6-BA、NAA、IBA，pH 调至5.8—6.0，蔗糖3%，添加不同浓度的琼脂粉或Gelrite，以及不同浓度的活性炭，组成各种培养基［9］(见表1)。

(2)分化培养基。以MS为基本培养基，附加不同浓度的 6-BA、NAA，pH 调至 5.8—6.0，蔗糖3%，添加0.2%Gelrite，组成各种培养基(见表2)。

表1 莲藕不定芽诱导培养正交设计实验结果

1.2.3 培养条件

温度为25±2℃，每天照光16 h，光照强度为1 000—2 000 Lux的培养室中培养。

2 结果与分析

2.1 不同培养基配比对莲藕不定芽诱导的影响

将莲藕的顶芽和侧芽纵切成0.3—0.5 cm3的外植体，按照表1所示的正交设计实验，接种在不同浓度配比的不定芽诱导培养基中初代培养，10 d左右可见不定芽萌发，但萌发结果差异较大。40 d后统计实验数据，结果如表1所示。实验表明不同外源激素浓度对莲藕茎尖不定芽的诱导有较大的影响。

2.1.1 不定芽诱导率结果分析

经过正交分析显示，比较极差(R值)大小，对诱导率的影响力由大到小为6-BA＞固化剂＞NAA＞IBA＞活性炭。由此可以看出，6-BA的浓度水平的变化对莲藕不定芽的诱导起主导作用，其影响极差(R值)可达58.325，比较K值，其作用效果为K1最小，K4最大，因此随着6-BA的浓度增加，诱导率也明显增加。其次为固化剂的影响，其作用效果值从大到小为K3＞K4＞K2＞K1，可见添加Gelrite比添加琼脂粉，对不定芽的诱导更有利，然而并不是浓度越高效果越好，其最佳浓度为0.2%。NAA的添加也对不定芽的诱导起到明显的作用，其R值为14.975，而K2值最大，说明添加低浓度的NAA对不定芽的诱导更为有利。IBA和活性炭对诱导率的影响不大，其极差分别为10和6.7。

综合考虑各种因素的影响，从诱导率的结果看，实验12和14的效果最好，均达到93.3%，其次为实验13，结果为86.7%。

2.1.2 不定芽诱导数目情况分析

表1的正交分析结果显示，对不定芽的诱导平均数影响的极值，从大到小为:6-BA＞NAA＞固化剂＞活性炭＞IBA。6-BA浓度大小的影响仍然最为显著，R值为 1.077，而 K值显示，K3最大，为1.89，说明1.0 mg/L6-BA 对不定芽数的诱导效果最佳。其次，NAA的添加也对不定芽的平均个数有较大的影响，其作用效果为K3最大。此外，固化剂的使用也影响不定芽的数目，从K值可以看出，添加Gelrite比添加琼脂粉更能促进不定芽的诱导数目。同样，IBA和活性炭的添加对平均个数影响不大。

不定芽诱导平均数最高的实验组为11号，可达2.75，而实验7、12、16 号均达到2 以上。

综合对诱导率和不定芽平均数的分析结果，初步认为是否添加IBA和活性炭对莲藕不定芽的诱导影响不大，考虑可以在今后的实验中去除。

2.1.3 不定芽状态分析

诱导出的不定芽的状态情况见表1所示。

当6-BA浓度较低，0或0.5 mg/L时，外植体易出现愈伤组织，其结构疏松。而当6-BA浓度较高，达到1.5 mg/L时，外植体普遍出现结节状硬块，结构致密，不易分化成苗，此外，我们还实验了2.0 mg/L的浓度，同样出现这种现象，且情况更为严重。当6-BA浓度为1.0 mg/L时，不定芽较为粗壮，颜色嫩绿，状态较好。

NAA对不定芽状态的影响同样较为显著，当其与6-BA的相对浓度较高时，外植体易出现愈伤组织，因此，选择较为合适浓度的NAA对于不定芽的状态调整极为重要。

固化剂的选择也影响着不定芽的状态，我们发现当使用琼脂粉作为固化剂时，外植体易褐化，诱导形成的不定芽往往呈现暗绿色，不易成活，而使用Gelrite后，则情况有所改观，不定芽普遍呈现嫩绿色，易于成活。若同时使用活性炭，则效果更佳。

2.2 不同培养基配比对莲藕不定芽分化的影响

将诱导培养产生的不定芽进行切分，并接种入分化培养基中，25 d后统计结果，如表2所示。

表2 莲藕不定芽分化培养结果

结果表明，6-BA对不定芽分化的存活率以及生长情况相较于NAA均有较大影响，其R值分别为74.966 和 0.576，而 NAA 的分别为 11.100 和0.153。随着6-BA浓度的增加，存活率明显提高，然而当浓度较高时(2.0 mg/L)，不定芽粗壮而伴有硬块，色暗绿。而当NAA浓度升高时，则常伴有少量愈伤组织发生，从而影响不定芽的生长。因此基于不定芽分化的结果分析，初步认为最佳的激素配比应为:1.0 mg/L的 6-BA 加 0.05 mg/L的NAA。

3 讨论

在莲藕不定芽的诱导和分化过程中，6-BA的作用效果比NAA更为显著，说明在一定范围内，细胞分裂素对莲藕芽的生长起决定作用。然而，随着其浓度的升高，培养组织易产生结节状硬块，因此，选择适当的浓度是得到高质量芽的关键。

茎尖培养的最大特点是可获得脱病毒苗。据李良俊等［10］研究认为，对莲藕不同生长时间取材进行比较后发现，取材于萌发时期的莲藕外植体，转绿和分化百分率均为最高，而取材于休眠期的外植体的转化率最低仅为8.8%，而且转绿的外植体几乎不能进一步分化。我们的实验结果发现，取材于萌发时期的野生莲藕外植体。切取不同大小的茎尖培养时，所获取无菌苗的比率与茎尖的大小成反比，愈接近茎尖的顶端，带病原菌的可能性就越少，所以我们采用的材料为较小的茎尖顶端。

此外，我们还发现，在莲藕的组织培养过程中，其外植体极易褐化，尤其在初代培养时，原因可能与莲藕中多酚氧化酶(PPO)的活性有关［11-12］。PPO在有氧气的情况下可催化多酚类物质［13］氧化成醌，醌再聚合成有色物质，导致莲藕褐化［14］。因此，我们在实验中采取了多种方法抑制莲藕外植体的褐化。首先，在切取外植体后应迅速接种，避免长时间暴露在空气中;其次，我们在初代培养时，加入适量的活性炭，可吸附部分醌类;我们还发现使用Gelrite代替琼脂作为固化剂可明显抑制褐化的产生，可能是由于Gelrite成分单纯，杂质少，渗透性强，使产生的醌更快扩散开的缘故;若褐化较为严重，我们也尝试采用抗坏血酸溶液浸泡外植体，可明显改善褐化现象。一般来说，初代培养比继代培养褐化比例高，只要度过初代培养，后期可不必采取抑制褐化措施，只要注意及时更换新鲜培养基即可。

［1］张福建 、王峰.莲藕组织培养与现状与展望文献［J］.上海农业科技，2000(4):10.

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