LC－MS/MS法测定人血浆中左炔诺孕酮的浓度及其药代动力学研究

蔡 珺，陈 新，郑 恒

(1.武汉工业学院生物与制药工程学院，湖北武汉 430023;2.华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部，湖北武汉 430030)

左炔诺孕酮为合成的强效孕激素，是消旋炔诺孕酮的光学活性体，活性比炔诺孕酮强1倍，约为炔诺酮的100倍。是目前应用较广泛的一种口服避孕药。药物口服吸收迅速而完全。口服后主要分布:肝、肾、卵巢及子宫。本药在肝内代谢，多以葡萄糖醛酸盐及硫酸盐形式从尿液和粪便中排出［1］。

由于左炔诺孕酮血药浓度低，且极易受内源性物质干扰，因此浓度测定比较困难。本试验旨在建立液相－串联质谱方法测定人血浆中左炔诺孕酮的浓度，适用于左炔诺孕酮的血药浓度监测和人体药代动力学的研究，为临床用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂与仪器

左炔诺孕酮片 (规格:1.5 mg/片，批号:100508);左炔诺孕酮标准品(中国药品生物制品检定所提供，批号:100076200703);内标:甲基睾丸酮对照品(湖北省食品药品监督检验研究所提供);乙腈(美国天地公司)，色谱纯;甲醇(美国天地公司)，色谱纯;乙醚(国药集团化学试剂有限公司)，分析纯;甲酸(天津市恒兴化学试剂制造有限公司)，分析纯;试验用水:Milli－Q超纯水。

高效液相色谱仪器:安捷伦1200液相色谱仪，含G1322A在线脱气机、G1311A高压四元泵、G1329A自动进样器、G1316A柱温箱;质谱仪器:API 4000 LC/MS/MS System，配备电喷雾离子化源(ESI)，美国 ABI公司;色谱工作站:Analyst 1.5;Adventurer电子分析天平;TL80－2医用离心机(江堰市天力医疗器械有限公司);TGL－16G台式高速离心机(上海安亭科学仪器厂);WH－1微型旋涡混和仪(上海沪西分析仪器厂)。

1.2 受试者选择

选择健康女性受试者20名，年龄范围为21—28岁，体质量指数为19—24 kg·m－2。无既往病史和药物过敏史，无烟酒嗜好，试验前2周内未服用任何药物，3个月未参加其他药物试验。试验前接受全面体检，结果均正常。受试者于试验前签署知情同意书。

1.3 给药方案及血样采集

本试验方案由华中科技大学同济医院医学伦理委员会批准。

受试者于试验前1周和试验期内禁饮各种饮料，禁烟酒，并在试验开始前一天进入I期临床试验病房，晚上进统一清淡饮食后开始禁食。于次日早晨空腹分别口服左炔诺孕酮片1.5 mg，用200 mL温开水送服;服药2 h后方可饮水，4小时后进统一标准餐(低脂肪饮食)。受试者服药后应避免剧烈运动，亦不得长时间卧床。整个实验过程在医生和护士的监护下进行。

于服药前(0 h)及服药后0.25 h，0.5 h，0.75 h，1.0 h，1.5 h，2.0 h，3.0 h，5.0 h，9.0 h，14.0 h，24.0 h，36.0 h，48.0 h 和 72.0 h，采集肘静脉血约 4 mL于肝素抗凝试管中，离心分离血浆(3000转/分，10 min)，血样置于－80℃保存待测。

1.4 检测方法

1.4.1 色谱和质谱条件

色谱条件:色谱柱:Ultimate C18(5 μm，2.1 ×150 mm);预柱:C18 保护柱(4 ×3.0 mm I.D.，美国Phenomenex公司);流动相:甲醇∶乙腈∶0.1%甲酸水溶液(80∶8∶12，V/V);流速:0.3 mL·min－1;进样量:5 μL;柱温:35 ℃。

质谱条件:离子检测方式:选择性离子检测(MRM);离子极性:正离子;离子化方式:气动辅助电喷雾离子化(ESI);检测对象:左炔诺孕酮，m/z 313.10—245.20;甲基睾丸酮，m/z 303.20—97.10;源电压(IS):5500V;源温度(TEM):550℃;碰撞气(CAD):4.0ps;气帘气(CUR):27psi;雾化气(GASl):40psi;加热辅助气(GAS2):60psi。

1.4.2 试验溶液的配置

标准品贮备液:精密称取左炔诺孕酮适量，以Milli－Q超纯水为溶剂溶解，定量配制成左炔诺孕酮浓度为 2.375 mg·mL－1，11.85 mg·mL－1，23.75 mg·mL－1，47.5 mg·mL－1，129.0 mg·mL－1，152.0 mg·mL－1，237.5 mg·mL－1的标准贮备液，以及浓度为0.655 mg·mL－1，9.5 mg·mL－1，19.0 mg·mL－1的质控溶液，置于4℃保存，临用时取出。

内标贮备液:精密称取甲基睾丸酮适量，以Milli－Q超纯水为溶剂溶解，按分子量换算后，定量配制成甲基睾丸酮浓度为123.6 mg·mL－1的溶液，作为内标贮备液，置于4℃保存，临用时取出。

1.4.3 血浆样品处理

精密吸取血浆1000 μL于10 mL玻璃离心管中，精密加入Milli－Q超纯水100 mL，加入内标液100 μL(123.6 μg/L)，混匀，涡混30 s，加入4 mL 乙醚，涡混3 min，于4 000 r·min－1离心5 min，取全部上层有机溶剂至10 mL玻璃管，40℃氮气流吹干，残留物用流动相溶液200 μL复溶，涡混30 s后转入 1.5 mLEP 管中，于 12 000 r·min－1离心 5 min，取上清液150 μL至自动进样瓶中，进样5 μL，进行LC－MS/MS测定，记录色谱图及待测物和内标的峰面积，采用内标法进行定量分析。

1.4.4 标准曲线的制备

取空白血浆，精密加入不同浓度的左炔诺孕酮标准溶液受适量，配制成相当于左炔诺孕酮血药浓度为 0.237 5 mg·mL－1，1.185 mg·mL－1，2.375 mg·mL－1，4.75 mg·mL－1，12.9 mg·mL－1，15.2 mg·mL－1，23.75 mg·mL－1的样品，按“1.4.3 血浆样品处理”同样操作。以待测物血药浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值f为纵坐标，用加权(w=1/x2)最小二乘法进行回归运算，求得标准曲线方程。

1.4.5 精密度、准确度与回收率

精密吸取空白血浆1 000 μL，精密加入左炔诺孕酮质控溶液100 μL，配制成相当于左炔诺孕酮血药浓度为0.655 mg·mL－1，9.5 mg·mL－1，19.0 mg·mL－1的低、中、高质控样品，按“1.4.3 血浆样品处理”同样操作，并进行含量测定。每个浓度5份样品，连续测定3 d，计算左炔诺孕酮的日内精密度、日间精密度与准确度。

将血浆与乙醚1∶4比例混合，涡混3 min，于4 000 r·min－1离心 5 min，取上清液，加入左炔诺孕酮质控溶液和内标液各100 μL，配制成浓度为0.655 mg·mL－1，9.5 mg·mL－1，19.0 mg·mL－1的血浆样品对照品，每个浓度样品3份;精密吸取空白血浆1 000 μL，按“1.4.3 血浆样品处理”同样操作，配制成相当于左炔诺孕酮低、中、高质控标准样品，每个浓度样品5份。对每个样品进行分析，比较2组峰面积，计算提取回收率。

1.4.6 稳定性

按“1.4.5精密度和准确度试验”项下的方法操作，配制4份含低、中、高3个浓度的血浆样品。1份样品在自动进样器中放置12 h，1份样品在室温放置12 h，1份样品反复冻融3次，1份样品－80℃冰冻30 d状态下的稳定性，对每份样品分析测试，考察血浆中左炔诺孕酮的稳定性。

2 结果

2.1 方法学评价

2.1.1 专属性

在本试验条件下，同时测定空白血浆、空白血浆+左炔诺孕酮标准溶液+内标对照溶液的血浆样品及受试者给药2.0 h后的血浆样品，特征色谱图见图1。由图可见，药物和内标的保留时间分别为2.49 min和2.70 min，峰形良好，无内源性物质干扰。

2.1.2 标准曲线和定量下限

结果表明本分析方法下左炔诺孕酮血药浓度在0.237 5—23.75 mg·mL－1范围内线性关系良好，标准曲线范围为 y=0.120x+0.00657(r=0.9971，n=6)，血浆中左炔诺孕酮的定量下限为0.237 5 mg·mL－1，RSD 值为 4.70%。

2.1.3 精密度、准确度与回收率

测定结果表明，血浆样品分析的精密度及准确度良好，低、中、高质控样品日内、日间RSD均小于3%，准确度在97%—105%。左炔诺孕酮的绝对提取回收率在79%—85%。结果见表1。

表1 左炔诺孕酮的精密度、准确度和回收率/%

2.1.4 稳定性

结果显示，所有稳定性考察样品实测浓度和加入浓度相比，浓度变化范围均在90%—110%之间，

图1 血浆中左炔诺孕酮和内标的MRN色谱图RSD＜5%，表明在本试验所考察的条件下，左炔诺孕酮的稳定性均良好。

2.2 药—时曲线

20名受试者单剂量口服左炔诺孕酮片后的平均药—时曲线见图2。

图2 20名受试者单次口服左炔诺孕酮片后的平均血药浓度—时间曲线

2.3 药代动力学参数

用梯形法计算AUC，以半对数作图法由消除相浓度点计算t1/2;Tmax和Cmax用实测值，结果见表2。

表2 20名受试者口服左炔诺孕酮片的主要药动学参数

3 讨论

左炔诺孕酮主要作用于下丘脑和垂体，使月经中期卵泡刺激素和黄体生成激素水平的高峰明显降低或消失，显著抑制排卵，有明显的抗雌激素活性，比炔诺酮强10倍左右，几乎不具有雌激素活性。本药对子宫内膜转化显示极强的孕激素活性，可使子宫内膜变薄，内膜上皮细胞呈低柱形，分泌功能不良，阻止孕卵着床。而且能使宫颈粘液变稠，阻碍精子穿透。从而起到避孕的作用［1］。

根据国内外文献的报道［2－7］，测定左炔诺孕酮血药浓度的方法有气质联用法、液质联用法、发射免疫法等，但这些测定方法样品处理过程复杂，且灵敏度低，不能很好的满足左炔诺孕酮的药代动力学等的研究要求。

本试验在液相条件优化的过程中，通过大量比较试验，最终选定甲基睾丸酮作为内标。甲基睾丸酮在该试验分析条件稳定性和灵敏度均最好、出峰时间与左炔诺孕酮相近，峰形好且不干扰药物的测定。在提取剂的筛选过程中，对比了乙酸乙酯、正己烷、乙醚等不同的提取溶剂剂，结果显示，以乙醚作为提取剂，血浆背景峰最少，回收率最高，由于乙醚极易挥发，缩短了样品处理的周期。在流动相的摸索过程中，经过对比不同比例的甲醇、乙腈、水、甲酸水等混合溶剂体系和不同流速，结果表明，以甲醇∶乙腈∶0.1%甲酸水溶液(80∶8∶12，V/V)为流动相，流速为 0.3 mL·min－1时，灵敏度和峰形均最佳。

在本试验分析测定方法下，左炔诺孕酮在血浆里的检测限达到0.237 5 mg·mL－1，能更好的满足左炔诺孕酮的药代动力学和生物等效性的研究要求。

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