汪丽燕 李 滨 郑清华
桂林医学院附属医院消化内科1(534001) 哈尔滨医科大学附属第四医院消化内科2
Periostin又称成骨细胞特异性因子2(osteoblast-specific factor-2,OSF-2),是一种由二硫键连接而成的基质特异性细胞黏附分子,属于成束蛋白(fasciclin)家族成员,在骨和牙的形成、维持以及心脏发育中发挥重要调节作用。临床研究证据显示periostin参与了多种恶性肿瘤,如乳腺癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌等的发生、发展[1]。胃癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,晚期胃癌患者预后不良,术后复发和死亡率高。肿瘤细胞耐药性的产生是肿瘤化疗失败的主要原因之一,最终导致肿瘤复发和死亡,因此研究胃癌耐药性的产生机制对提高化疗效果具有重要意义。Li等[2]发现periostin mRNA和蛋白低表达于正常胃黏膜和良性胃黏膜病变组织,在胃癌原发灶和转移淋巴结中则呈过表达,且其表达增高与肿瘤分期有相关趋势,提示periostin在胃癌进展和转移中起重要作用。新近刘宇[3]的研究显示,胃癌患者periostin蛋白血清浓度和癌组织表达均显著增高,尤其是有淋巴结转移和浸润较深者;除参与胃癌细胞的生长、侵袭、转移和上皮-间质转换,periostin过表达还能降低胃癌细胞对化疗药物5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)诱导细胞凋亡的敏感性,但periostin参与胃癌化疗耐药性的机制尚未阐明。与既往研究结果不同,本课题组前期研究[4]通过构建表达人periostin全长序列的重组质粒并以之稳定转染periostin基因低表达的人胃癌细胞株,发现过表达periostin基因对人胃癌细胞的增殖能力并无明显影响。本研究应用前期研究构建的重组质粒稳定转染人胃癌细胞株,通过检测经化疗药物顺铂(cisplatin)或5-Fu处理的稳定转染细胞株的细胞凋亡情况以及凋亡相关蛋白细胞色素c、caspase-3、多聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]表达,明确periostin基因过表达对顺铂和5-Fu诱导人胃癌细胞凋亡的影响及其可能机制。
人胃癌细胞株SGC7901(American Type Culture Collection),表达人periostin全长序列的重组质粒pcDNA3.1-periostin(哈尔滨医科大学附属第四医院消化内科构建、保存[4]),Akt特异性抑制剂 MK-2206(Selleck Chemicals),顺铂、5-Fu(Sigma-Aldrich Co.),BD PharmingenTMAnnexin V∶FITC 凋亡检测试剂盒(BD Biosciences),小鼠抗人细胞色素c单克隆抗体、小鼠抗人 β-actin单克隆抗体、小鼠 IgGHRP、兔 IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology,Inc.),兔抗人 cleaved caspase-3单克隆抗体、兔抗人cleaved PARP单克隆抗体(Cell Signaling Technology,Inc.),Amersham ECL Plus蛋白质印迹法检测试剂(Life Sciences,GE Healthcare)。流式细胞仪(Bio-Rad Laboratories,Inc.),全自动数码凝胶图像分析系统(上海天能科技有限公司)。
1.细胞培养:SGC7901细胞使用RPMI1640完全培养基,于37℃、5%CO2培养箱内培养,取对数生长期细胞进行实验。
2.稳定转染细胞株的构建:稳定转染pcDNA 3.1-periostin重组质粒和稳定转染pcDNA3.1空载体的SGC7901细胞株的构建步骤参照本课题组前期研究[4]。
3.流式细胞术检测细胞凋亡:将稳定转染periostin和稳定转染空载体的细胞株以及未转染细胞株按2×104/孔接种于96孔板,以 MK-2206(1 μmol/L)预处理30 min后,加入不同浓度顺铂(0、1、3、5 μmol/L)或 5-Fu(0、1、5、10 μmol/L)处理24 h。收集各组细胞,按凋亡检测试剂盒说明书进行操作,染色完毕后立即上流式细胞仪检测。Annexin V染色阳性细胞为早期凋亡细胞,PI染色阳性细胞为坏死细胞,Annexin V和PI染色双阳性细胞为晚期凋亡细胞,Annexin V和PI染色双阴性细胞为正常活细胞。
4.蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白表达:将稳定转染periostin和稳定转染空载体的细胞株以及未转染细胞株按5×105/孔接种于12孔板,以 MK-2206(1 μmol/L)预处理30 min 后,加入5 μmol/L顺铂或10 μmol/L 5-Fu处理24 h,同时设置不予转染、亦不予顺铂或5-Fu处理的空白对照组。细胞密度达到70% ~80%时收集各组细胞,提取蛋白,BCA法蛋白定量。取50 μg总蛋白上样,行SDS-PAGE电泳,转膜,封闭,一抗、二抗孵育,ECL显影、定影,凝胶图像分析系统扫描、分析。
流式细胞分析显示,顺铂和5-Fu处理24 h均可诱导SGC7901细胞凋亡,作用呈剂量依赖性(P<0.05)。与空载体稳定转染组和未转染对照组相比,periostin稳定转染组 SGC7901细胞对顺铂和5-Fu诱导的细胞凋亡具有显著抗性(P<0.05),5 μmol/L顺铂和 10 μmol/L 5-Fu 分别可诱导约14%和约10%的空载体稳定转染组细胞发生凋亡,但仅分别可诱导约8%和约6%的periostin稳定转染组细胞发生凋亡(见图1),表明periostin基因过表达可抑制顺铂、5-Fu诱导的SGC7901细胞凋亡。
图1 各组SGC7901细胞顺铂或5-Fu诱导的细胞凋亡率比较(流式细胞分析)
蛋白质印迹法检测显示,不予转染、不予顺铂或5-Fu处理的空白对照组SGC7901细胞胞质细胞色素c、cleaved caspase-3、cleaved PARP 蛋白表达微弱。顺铂和5-Fu处理24 h均可促进SGC7901细胞的细胞色素c由线粒体释放至胞质,同时caspase-3激活,PARP剪切增强。与空载体稳定转染组和未转染对照组相比,periostin稳定转染组SGC7901细胞的胞质细胞色素 c、cleaved caspase-3、cleaved PARP 蛋白表达均明显下调(见图2),表明periostin基因过表达可逆转顺铂、5-Fu诱导的SGC7901细胞线粒体细胞色素c释放以及caspase-3活化,系通过抑制线粒体依赖性凋亡途径抑制SGC7901细胞凋亡。
图2 各组SGC7901细胞顺铂或5-Fu诱导的凋亡相关蛋白表达比较(蛋白质印迹法)
Periostin基因在多种恶性肿瘤中具有促进肿瘤生长和进展的活性。以RNA干扰技术沉默前列腺癌细胞株LNCap的periostin表达,细胞体外和体内(移植瘤)生长速度均明显减慢,体外迁移能力降低[5]。对于periostin低表达的胰腺癌细胞株[6]和肺腺癌细胞株[7],表达外源性 periostin可促进细胞增殖、迁移和侵袭。以periostin中和抗体处理存在periostin表达的小鼠乳腺癌细胞株4T1,可显著抑制细胞的增殖、迁移、侵袭能力,延长细胞存活时间[8]。对于非肿瘤细胞如分化的哺乳动物心肌细胞[9]和皮肤成纤维细胞[10],periostin 同样显示出促细胞增殖活性。除促进肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭外,研究[3]发现periostin过表达尚与肿瘤细胞化疗耐药性的获得有关。既往研究[2,3]显示periostin参与了胃癌细胞的生长、侵袭、转移,本实验利用前期研究构建的表达人periostin全长序列的重组质粒,进一步探讨过表达periostin基因对人胃癌细胞化疗敏感性的影响,以明确该基因是否有望作为胃癌的潜在治疗靶点。
本实验流式细胞分析显示,常用化疗药物顺铂和5-Fu均能剂量依赖性地诱导人胃癌细胞株SGC7901凋亡,过表达periostin基因的SGC7901细胞则对顺铂和5-Fu诱导的细胞凋亡具有显著抗性。本课题组前期研究[4]发现上调 SGC7901细胞的periostin基因表达对细胞增殖能力无明显影响,结合本实验细胞凋亡检测结果,提示以基因转染技术过表达periostin对SGC7901细胞的主要作用为增强其对化疗药物诱导的细胞凋亡的抵抗能力,从而抑制其化疗敏感性。
细胞凋亡途径主要有两条:一条是通过细胞外信号激活细胞内凋亡蛋白酶caspases;另一条是通过线粒体释放凋亡蛋白酶激活因子激活caspases。Caspases属于半胱氨酸蛋白酶,其激活可引起胞内重要蛋白降解,进而引起细胞凋亡[11]。本实验应用蛋白质印迹法检测了一些凋亡相关蛋白在各组SGC7901细胞中的表达情况。线粒体细胞色素c可在细胞应激反应或凋亡信号的作用下释放至胞质,作为凋亡诱导因子,与Apaf-1、caspase-9前体、ATP/dATP形成凋亡体,进而募集并激活细胞凋亡效应分子caspase-3,引发caspases级联反应,导致细胞凋亡。PARP定位于细胞核内,与应激条件下的DNA修复密切相关,对于细胞稳定和存活具有重要意义。PARP在体内是caspase-3的主要剪切对象,被剪切后失去酶活性而加重细胞的不稳定性。PARP剪切被认为是细胞凋亡的重要指标之一,亦被认为是caspase-3激活的标记。本实验发现顺铂和5-Fu均可促进SGC7901细胞的线粒体细胞色素c释放,同时caspase-3激活,PARP剪切增强,而过表达periostin基因可逆转 SGC7901细胞由顺铂、5-Fu诱导的上述蛋白表达变化,胞质细胞色素c以及cleaved caspase-3、cleaved PARP蛋白表达均明显下调,从分子水平证实periostin的抗凋亡活性与抑制线粒体依赖性凋亡途径有关,这可能是periostin抑制人胃癌细胞化疗敏感性的机制之一。本课题组后续拟开展相关动物实验,探讨periostin在体内能否诱导胃癌细胞产生化疗耐药性,从而明确其作为胃癌潜在治疗靶点的可能性。
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