一种棒状杆菌对抗生素药物中间体废水的降解研究

贾漫珂 邹 嫚 王晓星 段淑敏 汪淑廉 黄应平

（三峡大学 三峡库区生态环境教育部工程研究中心，湖北 宜昌 443002）

抗生素废水主要来源于生产过程中原料提炼后的废发酵液，包括蒸馏回收溶液后的残留液及离子交换吸附后的废液及染菌倒灌的废液等，是一类高色度、难降解和生物毒性强的高浓度有机废水，化学需氧量（CODCr）一般为10g／L，有的甚至高达80g／L，悬浮固体（SS）也高达0.5～2.5g／L，每年排放量在5 000多万t以上，对环境造成了极大的危害［1－2］.物理技术、化学技术和物化生物联合技术是目前国内外处理抗生素废水的主要方法［3－4］.物理方法往往不能达到真正降解废水的目的，化学处理技术操作简单且效率高，但是设备成本及操作成本高，且容易带来二次污染.而生物处理技术则利用自然污泥中菌株的活动将废水中的有机物作为唯一碳源，达到处理废水中有机污染物的目的.该方法较物理和化学技术更加简单、成本更低，是一种无二次污染的绿色废水处理方法［5－7］.

本研究利用宜昌市一家国内最大的大环内酯类生化原料药生产基地废水为研究对象，通过对选定区域污泥样本进行选择性富集、驯化和划线分离纯化，筛选到一株能降解该企业抗生素废水的菌株，该菌株能在有氧条件下将废水降解和矿化.并通过正交实验，对其降解温度、pH及底物浓度进行探究，优化了该菌株降解抗生素废水实验条件.

1 实验部分

1.1 实验材料

1）抗生素废水：采样于宜昌原料药生产基地一企业废水排污口；2）污泥：污泥1（三峡大学校医院附近污泥）、污泥2（三峡大学求索溪底泥）、污泥3（三峡大学居民生活区池塘底泥）；3）培养基：富集培养基、无机盐培养基、牛肉膏蛋白胨培养基.

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的制备［8］

1）富集培养基的配制：称取胰蛋白胨、葡萄糖和NaCl各5.0g，苯甲酸0.5g，溶于一定量蒸馏水中，并用KH2PO4和K2HPO4各0.5g调节溶液pH为7.0～7.2；

2）无机盐培养基的配制：称取MgSO4·7H2O和NaCl各0.2g，CaCl20.1g，NH4NO31.0g，及少量的MnSO4·H2O溶解于一定量的蒸馏水中，加入适量苯甲酸并滴加1滴10%（W∶W）FeCl2溶液，以KH2PO4和K2HPO4各0.5g调节溶液pH为7.2；

3）牛肉膏蛋白胨培养基的配制：称取牛肉膏和NaCl各5.0g，蛋白胨10.0g，溶于一定量水中，并调节pH为7.2；

固体培养基需加入1.5%～2.0%（W∶W）琼脂.于121℃将培养基高压灭菌30min后备用.

1.2.2 菌株的筛选

筛选菌株分3个步骤进行［8－9］：

1）菌株的富集：将40mL富集培养基和10mL污泥分别加入3个250mL的锥形瓶中，即为3组：①抗生素废水＋污泥1；②抗生素废水＋污泥2；③抗生素废水＋污泥3，每组总体积为50mL.于30℃下，恒温振荡培养3d.

2）驯化：对以上3组进行菌种的驯化，每组平行设置3个样，须在富集程序的基础上加入无机盐培养液.将无机盐培养液、富集培养液及抗生素废水加入250mL锥形瓶中.30℃恒温振荡，驯化3个周期，每4 d为一个周期.每组的3个驯化培养液的总体积均为50mL，其中包含富集培养液10mL，无机盐培养液30 mL、20mL和10mL，抗生素废水体积则分别为10 mL、20mL和30mL.在每个驯化周期的前后分别进行COD的测定，并计算COD去除率，选择COD去除率最高的进行下一次的驯化培养，驯化过程重复3次.

3）分离纯化：在无菌条件下，驯化过程结束后，取COD去除率最高的培养液，以有废水与该培养液体积比3∶2的平板上进行划线分离，并在30℃恒温培养.挑选单菌落，通过反复的划线分离进行纯化，得到单一菌株.将纯化后的菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，4℃下保存.

1.2.3 菌株的鉴定

按照文献方法［7－8］进行菌株的鉴定.采用形态观察和生理生化实验相结合的方法，以伯杰细菌鉴定手册（第8版）［9］作为分类参考.观察分离纯化的菌株的生长情况、菌落特征和菌体形态结构，进行生理生化实验.

1.2.4 利用菌株降解抗生素废水

废水COD的测定参照GB 11914－89的K2Cr2O7法进行.以废水COD的去除率（%）对筛选得到的菌株的降解能力进行考察：

式中，COD0为菌株培养前的废水COD（mg／L）；COD为菌株培养一定时间后的废水COD（mg／L）.

1.2.5 菌株降解抗生素废水条件的优化

菌株降解废水的主要控制因素［9－13］为温度、pH和废水中底物的浓度，因此选取这3个因素并各设置5个水平，进行正交实验，分析废水降解的最佳条件，正交实验因素水平见表1，正交实验设计方案见表4.恒温振荡培养4d前后，测定培养液的COD，计算COD去除率，确定最佳降解条件.

表1 正交实验因素水平［7］

1.2.6 最佳条件下菌株对抗生素废水降解曲线的绘制

在正交实验确定的最佳实验条件下，将培养后的菌液按照20%的接种量接入废水的无机盐培养液中，恒温振荡培养.从开始培养的时间零点计时，吸取不同时间的培养液，并测定其中废水的COD，计算其COD去除率，得到最佳条件下菌株对抗生素废水的降解曲线.

2 结果与讨论

2.1 废水水质参数的测定

抗生素废水的各水质参数见表2.该废水的BOD／COD为0.38，根据废水可生化性评价参考数据（当0.3＜BOD／COD＜0.45时，废水具有较好的可生化性）可知该废水可以较好地被生化降解.因此可以通过微生物降解的方法降低废水中有毒有机污染物的含量.

表2 药物中间体废水的水质参数

2.2 菌株的驯化

菌株的驯化按实验方法1.2.2进行.以200mg／L为梯度从200mg／L开始，逐渐增大抗生素废水的浓度，对3个污泥样本中筛选得到的菌株进行3个周期的驯化，结果见表3.

表3 3次驯化过程中废水的COD去除率（%）

由表3中可知，第1次驯化后，污泥1中筛选得到的菌株对抗生素废水的COD去除率最大（达34.5%）.第2次驯化后，菌株对废水的COD去除率急剧增大，3个污泥样本中筛选得到的菌株对废水的COD去除率分别达到58.8%、40.7%和36.3%.而相对于第2次驯化，第3次驯化后COD去除率则有所降低，可能是因为第3次驯化时抗生素废水的浓度过高为600mg／L，抑制了微生物的生长，使COD去除率降低.3次驯化中，从3个污泥样本中筛选得到的菌株对抗生素废水降解能力顺序均为1＞2＞3.因此后续实验中选取污泥1的培养液进行划线分离，纯化为单一菌株，并研究此菌株对抗生素废水的耐受浓度，优化废水的降解条件.

2.3 菌种的筛选

在菌株的驯化过程中，培养液逐渐由澄清变为浑浊，表明培养液中有微生物的生长.经过对抗生素废水和污泥样本的富集、驯化、划线分离、纯化，在抗生素废水与无机盐培养液体积比为3∶2的平板上分离得到能高效降解废水的菌株.

2.4 菌株的鉴定

对分离纯化后的菌株形态进行显微镜观察，发现该菌株呈棒状.该菌落在平板上呈乳白色、棒状、无隆起、表面光滑湿润、不透明、边缘圆整.革兰氏染色阳性.为了确定其分类利用API细菌鉴定系统，用API Coryne试剂条鉴定DS菌株为棒状杆菌属（Corynebacterium spp.）.

2.5 菌株降解抗生素废水条件的优化

根据实验1.2.5的正交实验因素水平进行三因素五水平的正交实验.该正交设计共17组实验，每组实验设置3个平行样（见表4）.结果表明污泥1中的微生物对抗生素废水的降解率最高（37.8%）.

表4 正交试验方案设计及结果分析

利用软件SPSS 11.5对正交实验结果进行方差分析，可知3个因素对菌株降解抗生素废水的影响的重要顺序依次为温度＞底物体积浓度＞pH，温度对COD去除率的影响最大，底物体积浓度和pH的影响相对较小.当温为35℃，pH 6.0和底物体积浓度为300mL／L时DS菌株可以最有效地降解该企业抗生素废水.

2.6 菌株对抗生素废水降解曲线的绘制

利用DS菌株在最佳条件下对抗生素废水进行降解，取样时间间隔10h.抗生素废水的COD去除率随时间的变化如图1所示.由图1可知，最佳条件下，前20h内，废水的COD去除率很低，废水中的有机物几乎没有降解，可能是由于此时微生物尚处于适应期，没有完全适应环境条件，生长缓慢.在20～50h期间，COD去除率则急剧增大，表明该阶段微生物可能处于急剧的生长繁殖期，作为唯一碳源的废水有机物急剧的被消耗，因此抗生素废水的降解速度也急剧增大.60h时，菌株的数量达到最大值，抗生素废水的COD去除率也达到最大，之后随时间的继续延长，抗生素废水的COD去除率几乎不再发生改变，表明此时微生物进入了生长稳定期，菌株的数量不再增多.

图1 最佳条件下药物中间体废水的降解曲线

3 结 论

1）从污泥样品1中分离得到了可以以抗生素废水中的有毒有机污染物为唯一碳源的菌株DS，经鉴定该菌株为棒状杆菌属（Corynebacterium spp.）.

2）温度35℃、pH 6.0和废水浓度为300mL／L时，菌株DS对该抗生素废水的降解效率最高，可达37.8%.

3）由抗生素废水的降解过程可以看出，生物降解是一种降解药物生产废水的有效方法，其处理量大、降解效果明显、且不会产生二次污染，在工业实际中若与其他方法综合运用会具有更大的潜力.

［1］ 巩有奎，张林生.抗生素废水处理研究进展［J］.工业水处理，2005，25（12）：1－4.

［2］ 王亚卿，王路光，王靖飞，等.抗生素生产废水生化前预处理技术进展［J］.工业水处理，2007，27（10）：17－20.

［3］ 徐 森，胡晓东，郑秋辉.生物组合工艺处理抗生素废水现状及展望［J］.工业水处理，2011，31（2）：5－7.

［4］ Zhao C，Huang Y P，Fang Y F，et al.Visible Light－induced Degradation of Organic Pollutants Using Fe（Ⅱ）Supported on Silica Gel as an Effective Catalyst［J］.Chinese Science Bulletin，2008，53（10）：1497－1502.

［5］ 张 艺，李 义，李瑞萍，等.微生物降解麻醉药品生产废水的实验研究［J］.环境工程学报，2008，2（6）：780－784.

［6］ Wang S L，Zhang L P，Huang Y P，et al.Screening of Benzoic Acid Biodegradation Strains［J］.Wuhan University of Natural Sciences，2010，15（6）：527－531.

［7］ 王晓星，汪淑廉，陈登霞，等.制药废水有机污染物的微生物降解［J］.环境工程学报，2009，3（5）：834－838.

［8］ Wang C C，Lu K L，Chen X Y.Removal of Triethylamine from Synthetic Wastewater by Acclimated Mixed Bacteria Cultures［J］.International Biodeterioration ＆Biodegradation，2007，59（3）：202－205.

［9］ Buchman R，Gibbons E.伯杰细菌鉴定手册［M］.中国科学院微生物研究所《伯杰细菌鉴定手册》翻译组译.第8版.北京：科学出版社，1982.

［10］王晓星，黄应平，邹 雪，等.草甘膦废水有机污染物的微生物降解［J］.环境科学与技术，2010，33（8）：28－31.

［11］焦 阳，李菲菲，王晓星，等.一株微球菌对屠宰废水的处理研究［J］.环境科学与技术，2010，33（6E）：309－312.

［12］方艳芬，黄应平，苏 静，等.苯甲酸和苯胺的微生物降解研究［J］.环境科学与技术，2008，31（4）：68－71.

［13］涂志英，徐 玉，余 山，等.酵母发酵工业废水生物降解菌的筛选［J］.安徽农业科学，2011，39（33）：20462－20465.