益贞颗粒急性毒性实验研究

周继刚 贺海波 周 创 王海燕 罗 涛 陈茂华 潘经媛

（1.三峡大学 中医临床医学院（宜昌市中医院），湖北 宜昌 443001；2.天然产物研究与利用湖北省重点实验室（三峡大学），湖北 宜昌 443002；3.湖北省药物安全性评价中心，武汉 430061）

益贞颗粒由三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室、湖北省土家族医药研究所、宜昌市中医医院临床验方筛选制备而成，该方由湖北海棠叶、益母草等4味药组成.长期临床实践证明，益贞颗粒能有效治疗女性围绝经期综合症，明显改善临床症状，同时能调节内源性雌激素合成，并在一定程度上改善血清性激素水平，防止围绝经期因雌激素不足引发的骨质疏松及提高围绝经期综合症妇女的生活质量［1］.同时，通过动物实验也进一步证实：它可以降低去势大鼠骨转换率和骨吸收程度，提高骨小梁平均面积百分比，有效地防治绝经后的骨质疏松［2］.为了对其安全性作出客观、科学的评价，进一步指导临床用药，对益贞颗粒的急性毒性进行了初步研究，为其临床安全应用提供药理学依据.

1 材料与方法

1.1 药物

益贞颗粒由三峡大学中医临床医学院／宜昌市中医院试制，批号：120521.临用前用蒸馏水配成相应浓度的溶液.

1.2 动物

SPF级昆明种小鼠，雌雄各半，健康适龄，体重18.0～22.0g，三峡大学实验动物中心和湖北省实验动物研究中心提供，许可证号：SCXK（鄂）2008－0005和SCXK（鄂）2011－0012.动物按性别分笼，饲养于空调室内，室温（22±2）℃，湿度（60±5）%，喂标准颗粒饲料，自由饮水和摄食.

2 方 法

参照经典的急性毒性试验方法［3－8］，进行益贞颗粒对小鼠急性毒性实验研究.

2.1 半数致死量实验

取昆明小鼠40只，雌雄各半，随机分4组，每组10只，分别以益贞颗粒水溶液可供灌胃的最大混悬浓度（每1mL含1 000mg生药）为起始浓度，按组距0.1倍递减，即益贞颗粒以1 000.0、100.0、10.0、1.0 mg／mL的药物质量浓度，40mL／kg的灌胃体积分别各自4组实验小鼠灌胃给予相应质量浓度的药物一次，禁食4～5h后，按上述剂量重复给药一次.灌胃前禁食12h，饮水自由，灌胃后常规饲养，观察7d.记录小鼠死亡数.找出0%和100%的益贞颗粒致死浓度，计算出零致死量（Dn）和全致死量（Dm），进而计算出半数致死量.如果实验期间无小鼠死亡，无法计算半数致死量，则进行最大耐受量实验.

2.2 最大耐受量实验

取昆明小鼠40只，雌雄各半，随机均分为益贞颗粒给药组和对照组，每组20只.给药组分别以益贞颗粒可供灌胃的最大混悬质量浓度（每1mL含1 000 mg），小鼠灌胃可承受的最大体积（40mL／kg体重），1d内连续2次给药，两次给药时间相隔4～5h，灌胃前禁食12h，不禁水，间隔期间不供食，末次给药4h后常规喂食，观察14d.对照组以等体积蒸馏水灌胃，方法同给药组.

2.3 观察指标

2.3.1 半数致死量实验

观察各实验组小鼠在灌胃给药后2h之内，每15分钟观察1次；给药后2～4h之内，每0.5h观察1次；给药后4～8h之内，每1h观察1次；给药后8～24h之内，每4h观察1次；给药后第2d起，每天的上下午各观察1次，密切观察各小鼠的一般形态外观、行为活动、饮食情况、粪便形状及死亡数变化情况等.若有小鼠死亡，则将死亡小鼠解剖，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、小肠等脏器的改变，7d观察期结束后，将每组存活的小鼠处死进行解剖，对主要脏器以肉眼观察病理变化.

2.3.2 最大耐受量实验

各组灌胃给药后，正常饲养，给药当天连续观察6h，记录2次.以后每天观察记录一次，连续观察14 d.观察记录内容主要包括毛色、眼睛、呼吸、分泌物、排泄物、自主和中枢神经系统行为表现，以及动物死亡数目和死亡时间.记录每只动物出现毒性反应的症状的开始及消失时间；记录给药前及给药后1、2、3、7和14d动物的体重、进食量和饮水量.所有死亡和实验结束后处死的动物均进行尸检，观察并记录脑、心、肝、脾、肺、肾、睾丸／卵巢等主要脏器的病变情况，若肉眼可见病理变化则即刻进行组织病理学检查.

2.4 数据统计分析

3 结 果

3.1 半数致死量实验

益贞颗粒按40mL／kg灌胃体积，以1000.0、100.0、10.0、1.0mg／mL的质量浓度灌胃后，在灌胃后7d观察时间内，小鼠一般状态、行为活动、饮食情况、分泌物和排泄物等均未见明显异常，未见小鼠死亡；进行益贞颗粒灌胃前及灌胃后雌鼠和雄鼠第1～7d体质量增长和进食量各组间比较，均无显著性差异（P＞0.05），实验结果表明益贞颗粒对实验大鼠体质量增长与进食量无明显影响（见表1）.7d后，处死小鼠，肉眼观察其脑、心、肝、脾、肺、肾、睾丸／卵巢等主要脏器，均未见明显的病理学变化.因无法测出益贞颗粒的半数致死量，故进行其最大耐受量实验.

表1 益贞颗粒以半数致死量对实验小鼠体质量和进食量的影响（x±s，n＝10）

3.2 最大耐受量实验

3.2.1 实验小鼠一般状况观察

实验结果表明，实验小鼠以益贞颗粒最大混悬质量浓度和可承受的最大体积1d2次灌胃给药后，大部分小鼠出现自主活动减少、静卧不动、闭目、反应迟钝等反应，但无竖毛、懒动、抽搐、翻倒等异常情况，空白对照组与给药组情况类似，上述症状在给药2h后恢复正常活动.连续观察14d，小鼠无出现死亡情况出现.

3.2.2 益贞颗粒对实验小鼠体质量的影响

由表2可知，雌鼠给益贞颗粒后体质量增长与对照组比较无显著性差异（P＞0.05）；雄鼠给益贞颗粒后在第一天体质量增长与对照组比较有显著性差异（P＜0.01），但在随后的第2、3、7、14d体质量增长与对照组比较无显著性差异（P＞0.05）.

表2 益贞颗粒以最大耐受量对实验小鼠体质量的影响（x±s，n＝10）

3.2.3 益贞颗粒对实验小鼠进食量的影响

由表3可知，各益贞颗粒组小鼠在给药第1、2、3、7、14d进食量与对照组比较均无显著性差异（P＞0.05）.

表3 益贞颗粒对最大耐受量实验小鼠进食量的影响（x±s，n＝10）

3.2.4 益贞颗粒对实验小鼠饮水量的影响

由表4可知，各给益贞颗粒组小鼠在给药第1、2、3、7、14d饮水量与对照组比较均无显著性差异（P＞0.05）.

表4 益贞颗粒对最大耐受量实验小鼠饮水量的影响（x±s，n＝10）

3.2.5 益贞颗粒对主要脏器的影响

实验观察结束后处死的动物均进行尸检，观察脑、心、肝、脾、肺、肾、睾丸／卵巢等主要脏器未发现有明显异常.

4 讨 论

本研究按照《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》的要求，首先进行益贞颗粒的半数致死量实验，小鼠在给药后无死亡，其一般状态、行为活动、饮食情况、分泌物和排泄物等均未见明显异常；肉眼观察其心、肝、脾、肺、肾等主要脏器，均未见明显的病理学变化.实验中未测出益贞颗粒的半数致死量，表明益贞颗粒的毒性极低.

在最大耐受量实验中，实验小鼠以益贞颗粒最大混悬质量浓度和可承受的最大灌胃体积1天2次灌胃给药后，部分小鼠出现自主活动减少、静卧不动、闭目等反应，但无竖毛、懒动、抽搐、翻倒等异常情况，空白对照组与给药组情况类似，上述症状在给药1～2h后逐渐恢复正常.各实验组小鼠在给药后第1、2、3、7、14d的体质量、进食量和饮水量的变化，与空白对照组比较无显著性差异；肉眼观察各主要脏器未发现有明显异常.

本研究在灌胃给药无法测出益贞颗粒半数致死量的情况下，进行最大耐受量实验.益贞颗粒进行小鼠灌胃给药的最大耐受量折合成人临床日用量为93倍.因此，益贞颗粒急性毒性较小，在常规剂量下服用是安全、可靠的.

［1］ 周继刚，穆 怡，索红梅，等.化红胶囊治疗围绝经期综合征50例临床研究［J］.世界中西医结合杂志，2012，7（7）：583－585.

［2］ 周继刚，薛冰洁，曹 丹，等.化红胶囊对去势大鼠骨质疏松的影响［J］.中国医院药学杂志，2012，32（8）：587－590.

［3］ 徐叔云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学［M］.第3版.北京：人民卫生出版社，2002：366.

［4］ 谢元璋，孙 蓉，张亚囡.养血生发胶囊对小鼠急性毒性实验研究［J］.中国药物警戒，2011，8（4）：208－211.

［5］ 管小江，李光来，侯新华，等.新疆天山乌头草的急性毒性试验研究［J］.中华中医药杂志，2011，26（8）：1850－1852.

［6］ 陈 奇.中药药理研究方法学［M］.北京：人民卫生出版社 ，2006：107.

［7］ 中华人民共和国卫生部药政局.中药新药研究指南（药学 药理学 毒理学）［M］.北京：人民卫生出版社，1994：209，203.

［8］ 李运景，赵伟国，陈钧茂，等.痛经康口服液镇痛、抗炎和急性毒性作用研究［J］.中国药房，2011，22（39）：3658－3660.