鸭坦布苏病毒感染导致种鹅产蛋性能下降及死亡的病因分析

，，， ， ，黄建，

(余姚市禽畜病防治研究所，浙江余姚 315400)

自2012年7月以来,浙江和江苏境内部分种鹅场的种鹅发生一种以产蛋率下降，并有少量死亡的疾病，使部分种鹅场遭受了巨大经济损失。病鹅主要表现为食欲减退，排黄绿色粪便，部分病鹅出现神经症状，头颈扭曲，发病10 d后，产蛋率下降70%～80%，采用多种抗生素治疗，无明显效果。

为探明近期引起浙江和江苏部分地区种鹅产蛋性能下降并引起死亡的病因，为制定鹅病防治措施提供依据。笔者对浙江和江苏境内三家发病典型的种鹅场进行系统病原研究，现报告如下。

1 材料与方法

1.1细菌分离 病料采自浙江和江苏境内三家种鹅场的病死鹅。无菌采集肝脏划线接种于麦康凯和血平板上，37℃培养24 h。另外，用肝脏直接涂片，进行瑞氏染色和革兰氏染色。

1.2RT-PCR检测 采集病死鹅肝脏、脾脏及出血、坏死的卵泡膜，常规法匀浆，反复冻融3次，用RNAsimple Total RNA Kit提取RNA，用AMV反转录酶反转录合成cDNA，具体操作按说明书进行。按照国家农业行业标准的禽流感RT-PCR检测方法进行禽流感检测[1]；按照Liu(2007)[2]建立的新城疫病毒检测方法进行新城疫病毒检测；鸭坦布苏病毒检测采用本实验室建立的鸭坦布苏病毒RT-PCR检测方法检测：RT-PCR方法扩增的目的片段为420 bp，PCR反应体系为25 μL：2×Taq PCR Master Mix(购自TIANGEN)12.5 μL，上下游引物各0.5 μL(20 pmol/μL)，模板2 μL，用水补充体积至25 μL；反应程序为：94℃预变性4 min，按94℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃ 30 s进行35个循环，然后72℃延伸7 min结束反应，取5 μL PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳观察PCR扩增结果。

1.3病毒分离 无菌采集3家种鹅场(分别标记为场1、场2、场3)的病死鹅脾脏，出血、坏死卵泡膜，按常规方法匀浆，反复冻融3次后，离心15 min(8000 rmp/min)，取上清液用直径为0.22 μm的一次性无菌滤器过滤后，各接种9日龄SPF鸡胚5枚，去除24 h内死胚，观察鸡胚死亡情况。收集24 h后死胚及5 d内未死活胚尿囊液，按常规方法进行血凝试验[3]，并按照1.2方法进行鸭坦布苏病毒检测。

2 试验结果

2.1病变观察 主要病变为脾脏肿大，有大量白色坏死点；卵泡膜充血、出血，卵泡液化、坏死，有的卵泡破裂(详见图1)；部分病鹅肝脏肿大，其他脏器无明显病变。

2.2细菌分离 病死鹅肝脏直接涂片染色镜检，在1000倍油镜下未观察到细菌，划线接种的麦康凯平板和血平板于37℃培养24 h后均无细菌生长。

2.3RT-PCR检测 病料组织RNA，分别进行禽流感、新城疫和鸭坦布苏病毒检测，结果3份病料只有采用鸭坦布苏病毒检测引物PCR扩增获得特异性片段，且大小与目的片段一致(详见图2)。

图1 剖检病变

M：1500 bp DNA Marker；1：阳性对照；2,3,4：检测样品；5：阴性对照

2.4病毒分离 病料接种SPF鸡胚后4 h，场1、场2均有4枚鸡胚死亡，死胚尿囊液中有大量尿酸盐，肝脏、肾脏出血肿大。收集死胚和活胚尿囊液常规血凝试验。结果所有尿囊液均不能凝聚1%鸡红细胞。对尿囊液进行鸭坦布苏病毒RT-PCR检测，只有死胚尿囊液能扩增出特异性目的片段，表明分离到的两株病毒为鹅源鸭坦布苏病毒。

通过对3家种鹅场送检的病死鹅进行剖检病变观察，病料细菌分离、RT-PCR检测及病毒分离，结果表明鸭坦布苏病毒感染是导致种鹅产蛋率下降的主要病因。

3 小结与讨论

鸭坦布苏病毒是2010年4月出现的一种新病毒，陆新浩等(2012)[4]首次报道浙江地区的蛋鸭发生一种以产蛋率大幅下降为主要特征的新疫病，但未对该病原进行鉴定。随后曹贞贞等[5-8]通过病毒分离、RT-PCR扩增和基因序列分析等系统研究证实该病的病原为鸭坦布苏病毒，属黄病毒科(Flaviviridae)、黄病毒属(Flavivirus)的一种新病毒，病毒粒子呈球形，直径为30～50 nm的有囊膜单股正链RNA病毒。目前对鸭坦布苏病毒病的确诊主要依靠病毒分离和分子生物学检测[9]。

目前，鹅感染鸭坦布苏病毒的资料报道较少，据黄欣梅(2011)[10]报道，2010年4月至11月在江苏地区的鹅群曾发生鸭坦布苏病毒感染，造成种鹅产蛋率大幅下降、肉鹅大批死亡，部分病鹅出现神经症状，主要病变为卵巢、脑膜、肝脏等多器官出血，脾脏肿大坏死。临床症状和剖检病变与本研究病例症状基本一致。另外，为了确诊引起近期浙江及江苏部分地区种鹅产蛋率下降病因，笔者曾对病死鹅进行了RT-PCR检测和病毒分离，证实该病的病原是鸭坦布苏病毒。有关鸭坦布苏病毒的流行规律、病原特性、防治措施等有待进一步研究探讨。

[1] 国家农业行业标准“禽流感病毒RT-PCR试验方法”[S].NYT 772-2004.

[2] Liu H, WangZ, Wu Y, etal. Molecular epidemiological analysis of Newcastle disease virus isolated in China in 2005 [J]. J Virol Methods,2007,140:206-211.

[3] 殷震,刘景华.动物病毒学[M].2版.北京:科学出版社,1997:262-264,351-354,632.

[4] 陆新浩，陈秋英，刘鸿，等. 当前产蛋鸭产蛋骤然下降的病因初探[J].中国家禽，2010,32(23)：49-50.

[5] 曹贞贞,张存,黄瑜,等.鸭出血性卵巢炎的初步研究[J].中国兽医杂志,2010,46(12):3-6.

[6] 万春和,施少华, 程龙飞, 等. 一种引起种(蛋)鸭产蛋骤降新病毒的分离与初步鉴定[J].福建农业学报,2010,25(6):663-666.

[7] Su J, Li S, Hu X, et al. Duck Egg-Drop Syndrome Caused by BYD Virus, a New Tembusu-Related Flavivirus [J]. PlosONE, 2011,6(3):e18106.doi:10.1371/journal.pone.0018106.

[8] Yan P,Zhao Y,Zhang X,et al.An infectious disease of ducks caused by a newly emerged Tembusu virus strain inmainland China [J].Virology,2011,417(1):1-8.

[9] 朱丽萍，颜世敢.鸭坦布苏病毒研究进展[J].中国预防兽医学报，2012，20(1):79-82.

[10] 黄欣梅，李银，赵冬敏等.新型鹅黄病毒JS804毒株的分离与鉴定[J].江苏农业学报，2011，27(2)：354-360.