HPLC法测定人血浆中万古霉素浓度及其药动学研究

刘胜男，王佳庆，梅升辉，赵志刚

万古霉素(Vancomycin)是一种三环糖肽类抗生素，其药效较强，临床上主要用于革兰阳性菌，特别是敏感肠球菌和耐甲氧西林的葡萄球菌属(MRSA)所致的严重感染，也可用于难辨梭状芽胞杆菌等所致的系统感染和肠道感染。其主要的不良反应为肾毒性和耳毒性，严重者可导致肾衰竭和听力丧失［1］。万古霉素治疗窗较窄，因此，根据患者的临床情况，实施个体化给药显得尤为重要。国外指南认为［2］，检测万古霉素血药浓度是反映药物有效性最准确和最实用的方法，目前国内外很多医疗机构已经开展了该药的治疗药物监测(TDM)。本文通过查阅文献［3-5］，结合自身条件，建立一种快速测定法，并对健康志愿者的药动学进行研究，为临床安全、合理用药提供参考。

1 材料

1.1 仪器 日本岛津Class-VP高效液相色谱仪，包括LC-10AT输液泵和SPD-10A紫外检测器，色谱工作站软件;高速离心机SCILOGEX D2012;涡旋混合器MVS-1;电子天平(Mettler AE163);超低温保存箱(型号:MDFU32V);移液器 DRAGON MED。

1.2 试药 注射用盐酸万古霉素(批号:10356018，规格 500 mg/瓶，Eli Lilly Japan K.K，Seishin Laboratories);万古霉素标准品(批号:BCBD7944V:SIGMA);乙腈(色谱纯，批号:112189，Fisher公司);磷酸 (分析纯，批号:20110602，北京化工厂);磷酸二氢钾(分析纯批号，10017692，北京化学试剂公司);空白血浆为健康志愿者提供，来自北京血液中心;超纯水。

2 方法与结果

2.1 受试对象 选择3名健康男性志愿者，经心电图、血压、血尿常规及肝肾功能检查均正常。受试者均了解所进行试验的目的、方法和意义，并书面签署知情同意书。本试验方案通过首都医科大学附属北京天坛医院伦理委员会讨论通过。

2.2 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流动相:乙腈-磷酸二氢钾缓冲溶液(30 mM，pH 3.2)=10∶90(v/v)，流速 1.0 mL/min，进样量 20 μL，紫外检测波长236 nm，柱温20℃。

2.3 标准溶液及沉淀剂的配制 精密称取万古霉素标准品20.0 mg，置于5 mL容量瓶中，加入30 mM的磷酸二氢钾缓冲液至刻度，定容摇匀，配制成4 mg/mL的标准储备液。取标准储备液适量，分别用30 mM的磷酸二氢钾缓冲液稀释至50、100、200、500、1 000、2 000 μg/mL 的标准溶液，所有配制成的溶液置于4℃冰箱保存备用。

2.4 血清样品的处理 取血浆180 μL，加入标准溶液 20 μL，摇匀，加入 10%高氯酸溶液 80 μL，涡旋1 min，12 000 r/min离心 10 min，取上清液20 μL进样检测。由药物峰面积带入外标峰面积的标准曲线求得万古霉素的浓度。

2.5 标准曲线的绘制 取空白血浆180 μL，依次加入“2.3”项下万古霉素标准溶液20 μL，配制成相当于血药浓度为 5、10、20、50、100、200 μg/mL的血浆样品，每一浓度为3样本，按“2.4”项下方法操作。以外标法定量，以万古霉素浓度(X)为横坐标，血浆中万古霉素峰面积(Y)为纵坐标，进行回归运算，求得直线回归方程为Y=3 126.8 X+1 3238(r=0.9 982，权重系数=1/x2)。结果表明，万古霉素血药浓度在5～200 μg/mL范围内线性关系良好，定量下限为5 μg/mL。

2.6 专属性试验 取志愿者空白血浆200 μL，按“2.4”项下方法操作(不加标准溶液)，进样20 μL，得色谱图1A;取志愿者空白血浆 200 μL，按“2.4”项下方法操作(加标准溶液)，同法操作，得色谱图1B;取健康志愿者注射给药后的血浆样品，同法操作，得色谱图1C，结果万古霉素的保留时间为13.5 min，且空白血浆中的内源性物质不干扰万古霉素的测定。

图1 血浆中万古霉素色谱图

2.7 相对回收率与精密度试验 制备含万古霉素浓度分别为5、201、160 μg/mL的血浆样品各5份，按“2.2”项下操作，记录万古霉素峰面积。另配含万古霉素浓度分别为5、20、160 μg/mL的标准溶液 200 μL各5份，加入10%高氯酸溶液80 μL混匀，涡旋混合 1 min，取上清液 20 μL 进样，记录万古霉素峰面积。以每一浓度2种处理方法的峰面积比值计算绝对回收率，结果见表1。

表1 绝对回收率及精密度试验结果(±s)

表1 绝对回收率及精密度试验结果(±s)

理论值(μg/mL) 测得量(μg/mL) 日内RSD(%) 日间RSD(%) 绝对回收率(%)10 8.7±0.69 3.57 4.50 79.77 50 53.6±0.76 0.97 0.90 69.76 160 172.02±7.03 0.46 4.10 71.34

2.8 稳定性试验 本文考察了低、中、高(10、50、160 μg/mL)3种浓度的万古霉素血浆样品处理后室温放置10 h、-70℃冰箱冷冻8 d、反复冻融2次样品的稳定性。见表2。结果表明，万古霉素在室温放置冻融状态下稳定。

表2 万古霉素稳定性考察(n=5)

2.9 实际样品测定与药动学研究 3名健康志愿者在1 h内静脉滴注万古霉素500 mg，分别于给药前及静脉滴注后 0.25、0.5、0.75、1、1.5、3、6、12 h时采集静脉血约2 mL，置于肝素管中，3 500 r/min离心10 min，血浆于-20℃保存。并按上述方法进行实际样品的测定，并以当日的标准曲线计算其浓度，同时配制低、中、高(10、50、160 μg/mL)3种浓度的QC样品，每一浓度进行5个样本分析，以确定当日结果的可靠性。应用本法测定了3名健康志愿者静脉滴注万古霉素500 mg后不同时刻的血药浓度，平均药-时曲线见图2。

根据测定结果，利用药动学软件Phoenix1.1计算万古霉素的主要药动学参数，结果Cmax为21.13 μg/mL，tmax为 0.95 h，t1/2为 11.55 h，AUC0-∞为 218.00 μg·h/mL。

图2 健康志愿者静脉滴注万古霉素500 mg后的平均药-时曲线

3 讨论

本试验采用乙腈-30 mM磷酸二氢钾缓冲液(10∶90，v/v)为流动相，在调整两者比例时发现，内源性物质的出峰时间约为3 min，乙腈比例增加时，目标峰出峰时间提前，内源性物质干扰增强，减少乙腈比例，目标物质出峰受内源性物质干扰减少，但峰型较差，调节流动相pH至3.2，目标峰拖尾现象明显减少，色谱峰型有所改善。

本试验采用外标法，由药物峰面积带入外标峰面积的标准曲线求得万古霉素的血浆浓度。目前国内相关文献多用内标法［6-8］，如去甲万古霉素、维生素B、替硝唑等，由于这些内标多为临床常用药，如果待测患者同时服用万古霉素和内标物质，内标物质可能作为内源性杂质干扰检测结果，因此不能准确计算万古霉素的血药浓度。虽然外标法简便，但对仪器的重现性和操作条件的稳定性要求较高，需定期进行曲线校正。

万古霉素为水溶性物质，其血浆样品提取方法多采用蛋白沉淀法，文献报道的沉淀剂有10%三氯醋酸溶液、30%硫酸锌溶液、乙腈-异丙醇等，本试验曾根据以上文献方法对血浆样品进行处理，结果发现外标曲线线性均不太理想，分析原因可能为操作较繁琐，沉淀剂用量较大。选择10%高氯酸沉淀蛋白，加入量少，色谱中杂质峰与目标峰分离较好，线性曲线较为理想。另外，此法样品处理简单，只需沉淀离心，可定量测定到1.7 μg/mL，此定量下限足以满足受试者静脉滴注500 mg万古霉素的药动学研究需要。

国外指南《万古霉素治疗成人金黄色葡萄球菌感染的治疗监测实践指南》认为，金黄色葡萄球菌暴露于万古霉素谷浓度＜10 μg/mL时，可产生具有万古霉素中介金葡菌样特点，因此，推荐其血药浓度谷值应保持＞10 μg/mL以避免发生耐药;为改善临床感染治疗的预后，提高药物的组织渗透能力，指南推荐万古霉素血药浓度谷值应维持在 15 ～20 μg/mL，本方法快速、简便、准确、灵敏，为临床开展万古霉素血药浓度监测提供了参考方法。

［1］陈新谦，金有豫，汤光.新编药物学［M］.第17版.北京:人民卫生出版社，2011:85-86.

［2］Michael J，Rybak BM，Lomaestro JC，et al.Vancomycin therapeutic guidelines:a summary of consensus recommendations from the infectious diseases society of America，the American Society of Health-System Pharmacists，and the Society of Infectious Diseases Pharmacists［J］.Clin Infect Dis，2009，49(3):325-327.

［3］王佳庆，梅升辉.RP-HPLC法同时测定人体血清及脑脊液中万古霉素的含量［J］.药品评价，2012，9(23):22-25.

［4］范捷，郭志磊，于洋，等.高效液相色谱法测定万古霉素血药浓度［J］.中国医院药学杂志，2012，32(19):1590-1591.

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