3种真菌直接镜检溶液诊断甲真菌病的比较研究

阳 眉，兰长贵，梅晓锋

（核工业四一六医院皮肤性病科，成都 610051）

真菌镜检是实验室诊断皮肤真菌病最常用的方法，10%～30%氢氧化钾（KOH）溶液是常规使用的角质溶解剂［1］，但对于指、趾甲标本，甲屑不易溶解。为了更快、更准确地诊断病指、趾甲中的真菌，作者于2010年3～8月采用10%KOH溶液（第1组）、20%KOH溶液（第2组）、20%KOH与40%二甲基亚砜（DMSO）复合溶液（第3组）3种溶液对60例指、趾甲标本进行单盲对照研究，以真菌培养为金标准，比较分析3种溶液诊断指、趾甲标本真菌的敏感性、特异性、阳性率以及真菌菌丝平均显现时间，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 入选共60例标本，指甲标本24例，趾甲标本36例，其中男32例，女28例。平均年龄（42.3±13.1）岁。病程2周至20年，平均（8.2±2.3）月。入选标准：临床怀疑甲真菌病患者，年龄、性别不限。排除标准：就诊前1个月内系统或外用抗真菌药物。

1.2 材料 10%KOH 溶液、20%KOH溶液、20%KOH与40%DMSO复方溶液、沙保培养基［1］。

1.3 方法 75%的乙醇消毒病甲表面，用钝刀刮取甲下鳞屑，将碎屑标本均匀分成4份，其中3份标本分别置于3张新玻片上，用3种溶液分别滴加在玻片上，阅片并计时，记录真菌菌丝显现的时间直至30min；1份接种在沙保培养基27℃培养4周，依据形态学、生化反应鉴定菌种［1］。以培养结果作为诊断金标准。

1.4 单盲设计方法 由一名医生分别用3种溶液制片并编号，另一名医生统一阅片并记录结果，阅片者不知晓试剂成分，对阅片者采用单盲设计，减少观察过程中的偏倚。

1.5 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件进行统计学分析，率的比较用χ2检验，平均时间比较用t检验，检验水准α取0.05。

2 结 果

2.1 3种真菌镜检溶液镜检及培养结果 在60例指、趾甲标本中，3种真菌镜检溶液镜检阳性例数分别为32、39、40例；镜检和培养同时阳性例数分别为28、36、38例，呈逐渐增加。60例指、趾甲标本中真菌培养阳性46例，阴性14例。3种真菌镜检溶液各镜检和培养结果见表1。

表1 3种溶液镜检及培养结果（n＝60）

2.2 3种溶液的敏感性、特异性和阳性率 见表2。将3组溶液的敏感性进行χ2检验，结果显示第1组与第2组比较χ2＝3.286，Р＝0.07；第2组与第3组比较χ2＝0.276，Р＝0.599；第1组与第3组比较χ2＝5.361，Р＝0.021。第1组与第2组、第2组与第3组敏感性差异无统计学意义，第1组与第3组敏感性有差异。3组溶液的特异性χ2＝0.848，Р＝0.654；阳性率χ2＝2.679，Р＝0.262，差异无统计学意义。

表2 3种溶液敏感性、特异性、阳性率（%）

2.3 3种溶液真菌菌丝平均显现时间 分别为（12.2±9.642）、（10.7±8.641）、（6.8±6.268）min。t检验显示第1组与第2组比较，t＝0.715；第2组与第3组比较，t＝0.263；第1组与第3组比较，t＝0.149，差异均有统计学意义。

2.4 真菌培养结果 分离出46株真菌，其中红色毛癣菌34株，须癣毛癣菌5株，石膏样小孢子菌2株，犬小孢子菌1株，白色念珠菌4株。皮肤癣菌仍是甲真菌病的主要致病菌。

3 讨 论

指、趾甲真菌病的诊断传统方法有KOH直接镜检和真菌培养。KOH直接镜检简单、价廉，但约有5%～15%呈假阴性［2］。真菌培养能鉴定菌种，特异性高于KOH镜检，但真菌培养时间长，若标本中真菌成分无活性可出现假阴性［3－5］。其他方法包括PAS染色、荧光白染色、体内共聚焦显微镜、聚合酶链反应、流式细胞术均应用于诊断，但多限于在相关的实验室［2－5］。因而在指、趾甲真菌病指南中仍以真菌的培养作为诊断指、趾甲真菌病的“金标准”［6］。

真菌镜检溶液中KOH碱性强，能软化和溶解角蛋白、脂肪及其他组织碎屑，使真菌形态清晰，1971年Rebell等发现加入DMSO后可以快速溶解角质而不需加热，更容易辨认真菌的结构，并能与人工假象相区别［5］。通过提高KOH浓度及添加渗透剂二甲基亚砜，促进角质细胞化学变性，使背景清楚，减少纤维织物和细胞间隙干扰，易于辨认，特别是针对指、趾甲标本有其优越性。

本研究发现加入了DMSO的KOH溶液能在10min内溶解指、趾甲标本，而10%KOH溶液溶解角质时间为10min以上。有学者研究对于皮屑标本甚至可在5min内完全溶解［3］。本研究结果显示，3种溶液特异性和阳性率差异无统计学意义，但20%KOH与40%DMSO复方溶液对指、趾甲标本有更高的敏感性，真菌显现更清楚，时间短，更助于真菌的识别，可以作为真菌镜检的筛选溶液。

本研究中指、趾甲屑标本取材部位的选择，标本量足够多，颗粒足够细是保证真菌镜检和培养成功重要因素，同时若对真菌成分进行浓缩或着色，镜检能更易分辨。

［1］ 吴绍熙.现代医学真菌检验手册［M］.北京：北京医科大学／中国协和医科大学联合出版社，1998：52-53，72.

［2］ Panasiti V，Borroni RG，Devirgiliis V，et al.Comparison of diagnostic methods in the diagnosis of dermatomycoses and onychomycoses［J］.Mycoses，2006，49（1）：26-29.

［3］ Singh S，Beena PM.Comparative study of different microscopic techniques and culture media for the isolation of dermatophytes［J］.Indian J Med Microbiol，2003，21（1）：21-24.

［4］ Dass，Goyal R，Bhattacharya SN.Laboratory-based epidemiological study of superficial fungal infections［J］.J Dermatol，2007，34（4）：248-253.

［5］ Wilsmann-Theis D，Sareika F，Bieber T，et al.New reasons for histopathological nail-clipping examination in the diagnosis of onychomycosis［J］.J Eur Acad Dermatol Venereol，2011，25（2）：235-237.

［6］ Reisberger EM，Abels C，Landthaler M，et al.Histopathological diagnosis of onychomycosis by periodic acid-Schiffstained nail clippings［J］.Br J Dermatol，2003，148（4）：749-754.