利用海带渣生产燃料乙醇的初步研究

明凯利，张 梅，王树春，臧家业，金滨滨，吴佐浩，王能飞

（1成都中医药大学药学院，四川 成都 611130；2国家海洋局第一海洋研究所，山东 青岛 266061）

随着化石能源渐趋枯竭和环境的不断恶化，研发应用各种新型可再生能源，走可持续发展的道路已得到世界各国的普遍共识。当前，在生物质能源中生物乙醇作为一种可再生能源，具有燃烧完全、效率高、无污染等特点[1]，因此被认为是最终能够替代化石燃料的理想能源之一。目前，我国制备纤维素燃料乙醇主要侧重于秸秆、木薯、甘蔗渣和木屑等陆源原料，对利用海洋生物资源特别是用海带等海藻加工废弃物制备生物乙醇的相关研究相对较少。

海带为褐藻的一种，是褐藻胶、甘露醇、碘等褐藻化工产品的主要原料之一。在海带工业利用过程中会产生大量的富含碳水化合物及营养盐等的废弃物，是极为丰富的可利用资源，其中在海藻酸钠的生产过程中产生的海带渣是海带工业中比例最大的固体杂质[2]。充分利用海带渣等海带化工废弃物，不仅能够变废为宝，减少资源的浪费；而且能有效的降低这些废弃物直接排放带来的水体富营养化和诱发赤潮等造成生态环境破坏的可能性[3]；此外，利用海带渣等废弃物生产附加产品，能降低褐藻相关产业的成本。

本实验以海藻酸钠生产过程中产生的海带渣为原料，并以当前制备燃料乙醇较常用的玉米秸秆作为对照原料，测定了海带渣中的纤维成分，并对海带渣进行了酶解发酵产乙醇的相关实验研究。在前期实验的基础上，比较了当前较为常用的稀酸、稀碱两种预处理方式对海带渣纤维素降解产糖及发酵产乙醇的效果，初步确立了海带渣同步糖化发酵的方式，并研究了南极低温纤维素酶QP7与常温酶组成的复配酶降解海带渣生产乙醇的效果，为进一步深入研究海带渣制备燃料乙醇作重要实验基础和技术参考。

1 材料和方法

1.1 实验样品

海带渣为青岛王哥庄海藻公司提供，将海带渣干燥后所得干渣经粉碎，并过40目筛作为实验原料以备用。

玉米秸秆来自青岛当地农田，干燥后经粉碎，并过40目筛作为实验原料以备用。

产低温纤维素酶 QP7菌种为本实验室保存菌种；酿酒高活性干酵母购自湖北安琪酵母股份有限公司。

1.2 样品纤维成分测定方法

在王玉万等[4]、薛惠琴等[5]及 Ververis等[6]方法的基础上，用改良的方法对样品中的纤维素、半纤维素、木质素等进行系统定量分析。具体步骤如下。

（1）实验操作 准确称取1 g样品分别经中性洗涤剂处理、2 mol/L盐酸水解处理、72%硫酸酸化处理、高温灰化处理等连续处理步骤，每步处理后的残渣均干燥至衡重（单位：g），分别为W1、W2、W3、W4。

（2）结果计算

半纤维素含量=（W1−W2）/样品重×100%

纤维素含量=（W2–W3）/样品重×100%

木质素含量=（W3–W4）/样品重×100%

每个样品成分测定至少 3组平行，结果取平均值。

1.3 样品预处理及酶解方法

1.3.1 酸处理

样品按1 g∶10 mL（2%硫酸）的料液量，装入三角瓶中封口，120 ℃高温处理1 h，冷却后，用碱液调pH值为中性。

1.3.2 碱处理

样品按1 g∶10 mL（1%氢氧化钠）的料液量，装入三角瓶中封口，120 ℃高温处理1 h，冷却后，用酸液调pH值为中性。

1.3.3 预处理液酶解糖化实验

将上述酸、碱处理液以25 IU/g样品的酶量，添加纤维素酶，在温度为48 ℃，转速为120 r/min的振荡条件下，酶解62 h。分别取0 h 和 62 h 的酶解液适量，离心后取上清糖化液，分别测还原糖浓度。

1.3.4 还原糖的测定方法

还原糖含量的测定采用 DNS（3,5-二硝基水杨酸）法[7]，所测葡萄糖标准曲线如图1所示。

2.4 样品发酵产乙醇实验

2.4.1 同步糖化发酵

（1）将样品分别按1.3节中的酸、碱方法处理后，添加酵母发酵营养物质，灭菌后调pH值，样品以25 IU/g酶活单位添加纤维素酶，并接种酵母活化液同步进行酶解发酵。

（2）发酵条件 酵母接种量 8%、发酵温度34 ℃、pH值约5.0、120 r/min振荡培养。分别测定其发酵22 h和46 h时乙醇浓度及还原糖含量。

（3）发酵营养物质 酵母粉 0.3%、蛋白胨0.5%、尿素0.02%、硫酸镁0.4%、磷酸氢二铵0.01%。

2.4.2 分步糖化发酵

将样品按1.3.3节中方法进行酶解62 h后，离心收集糖化液，添加酵母发酵营养物质，接种酵母进行发酵，具体发酵条件同2.4.1节。

2.4.3 乙醇测定方法

采用气相色谱（GC），用外标法测定发酵液乙醇含量。气相色谱条件为：进样口温度150 ℃；进样量 1 μL；载气 N2流量 25 mL/min，分流量 22 mL/min，隔垫吹扫2 mL/min，尾吹20 mL/min；柱温由50 ℃程序升温至100 ℃，升温速率为10 ℃/min，并在50 ℃和100 ℃分别保持1 min；FID检测器温度220 ℃；燃气H2流量20 mL/min；空气流量 150 mL/min；色谱柱为 DB-624，30 m × 250 μm ×1.4 μm。

2.5 低温纤维素酶QP7复配降解实验

2.5.1 低温纤维素酶的制备

将产低温纤维素酶 QP7菌株接种活化，在低温摇床上150 r/min，15 ℃培养4天。将QP7发酵后的离心液作为低温纤维素酶的粗酶液，并测定酶活。

2.5.2 滤纸酶活测定方法

取酶液0.5 mL，加入1.5 mL pH值为5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和定量滤纸条，于 38 ℃准确保温1 h，沸水浴20 min，冷却后定容至20 mL，在波长540 nm处测定吸光度，具体方法参考文献[8]。

2.5.3 QP7酶复配降解实验方法

样品以1 g∶10 mL的料液比经酸处理后，其中对照组一只加适量的低温菌QP7所产酶液，对照组二只加常温纤维素酶，实验组同时加等量总纤维素酶活的QP7酶液和纤维素酶，分别按2.4节中的方法在相同条件下进行同步糖化发酵，并测定发酵22 h的乙醇浓度含量。

2 结果与分析

2.1 样品纤维成分含量测定结果

表 1为海带渣和秸秆样品测得的纤维成分含量，从表1中可以看出海带渣含有数量较多的纤维素和半纤维素成分，尤其是纤维素含量达到了28.3%，接近于秸秆的33.6%。纤维素和半纤维素为多糖聚合物，是可以转化为醇类的多糖资源，特别是纤维素，通过酶解转化为单体葡萄糖，进而通过酿酒酵母发酵作用生产乙醇。实验表明，含有较高纤维素含量的海带渣利用潜力较大，具备作为乙醇生物质原料的重要优势，对其深入研究意义重大。

表1 样品纤维成分含量

2.2 海带渣酸、碱预处理效果比较

酸、碱预处理方法为纤维乙醇预处理技术中较多采用的方法，本实验分别从样品预处理后，酶解产糖及发酵产乙醇两个方面比较了酸、碱预处理对海带渣的降解效果，其中酸预处理所用的2%稀酸和碱预处理所用的 1%氢氧化钠分别为前期浓度优化实验所得。实验结果分别为图2﹑图3所示。

从图2可以看出，海带渣经稀酸处理后酶解62 h时还原糖浓度达到了31.1 mg/mL，高于其碱处理的22.6 mg/mL，而秸秆酸、碱处理后酶解62 h时还原糖浓度接近，分别为27.9 mg/mL和26.1 mg/mL，均低于海带渣经酸处理后酶解的糖浓度。由表1知，秸秆中纤维素和半纤维素含量均高于海带渣的，但降解后的糖浓度却低于海带渣的，这可能由于二者的组织结构不同所致，秸秆为陆生木质纤维素，结构致密难以彻底降解；而海带渣为水生植物海带经化学工业处理后，结构松散，纤维素成分容易剥离，易于降解。从酶解0 h还原糖浓度看，秸秆和海带渣经酸处理的糖浓度均高于碱处理的，如海带渣酸处理后（即酶解0 h）的糖浓度为6.2 mg/mL，高于其碱处理的2.9 mg/mL，这可能是由于酸、碱作用机理不同所致，酸性条件更适合分离海带中的纤维素成分。实验表明，海带渣经酸处理后得到了很好的降解，优于其碱处理的效果。

图3分别给出了酸、碱处理后的海带渣和秸秆发酵过程中糖浓度和乙醇浓度变化情况。由图3可以看出在发酵 22 h以后乙醇浓度和糖浓度基本不变，从发酵22 h产乙醇浓度看，相同条件下，海带渣产乙醇浓度均明显高于秸秆的，尤其是酸处理的海带渣产乙醇浓度达到了 1.01%，高于其碱处理的0.74%，而秸秆酸、碱处理的产乙醇浓度接近，均低于 0.60%；从糖浓度变化情况看，海带渣糖化液中的还原糖基本能被完全利用，如22 h碱处理的海带渣中糖浓度仅为1.81 mg/mL，而经酸、碱处理的秸秆发酵液中均有相当部分的糖不能被酵母利用，这可能是由于秸秆中半纤维素含量较高，降解了大量如木糖等不能被一般酵母利用的单糖。

实验表明，与当前广泛使用的玉米秸秆相比海带渣更易降解产糖，且乙醇产率更高；特别是经稀酸预处理后的海带渣能很好的被纤维素酶降解，经发酵得到较高浓度的乙醇，结合前期实验，初步确立了海带渣酸预处理方法。

2.3 两种发酵方式的比较

在上述实验的基础上，将酸预处理后的海带渣在相同条件下分别进行了同步糖化发酵和分步糖化发酵的实验，结果如表2所示。可以看出在发酵22 h时，同步发酵乙醇浓度为10.2 g/L，高于分步发酵的8.7 g/L。因此，从乙醇产率上看同步发酵比分步发酵高17%以上；而且，同步发酵能更好的转化利用糖，发酵液残余糖浓度为3.5 mg/mL，低于分步的4.2 mg/mL。此外，作为当前常用的两种基本发酵方式，同步糖化发酵具有简化设备，节约总生产时间，并能克服葡萄糖对纤维素酶的反馈抑制作用等诸多优点。综上因素，海带渣采用同步糖化发酵的方式生产乙醇比分步发酵法具有明显优势。

2.4 低温纤维素酶QP7复配降解效果

分别比较了在海带渣同步发酵中，低温QP7酶液、常温纤维素酶单独作用以及两种酶混合作用下的效果（图4）。在相同条件下， QP7酶组乙醇浓度为 0.32%，纤维素酶组乙醇浓度为 1.13%，均低于两酶混合组的1.37%。可见在QP7酶配合纤维素酶的作用下，产乙醇浓度提高21%以上。这可能是由于两种酶复配降解时相互间具有某种协同作用所致。此外，在纤维素乙醇生产中，纤维素酶的成本占纤维素乙醇总成本的60%以上，而复配酶的利用在提高乙醇浓度的同时也降低了蒸馏的成本，综合计算能够显著降低纤维素乙醇的生产成本，具有重要的应用前景。

表2 海带渣两种发酵方式的比较

在同步发酵中最大的问题是酵母的低温发酵温度与纤维素酶高酶解温度之间的矛盾，而当前研究中大多是取二者的折中温度，这既降低了纤维素酶的酶活，也影响了发酵效率[9-10]，而对低温纤维素酶的研究正是解决这一问题的较好办法之一。如本实验中所用低温QP7酶最适温度为38 ℃左右，这与酵母发酵温度基本适用，无疑具有重要的优势。本实验中利用低温QP7酶复配降解时效果明显，但单独使用时乙醇浓度偏低，因此在后续实验中有必要对低温QP7酶进行深入研究，以期提高其酶活及稳定性等。

3 结 语

本实验对海带渣进行了纤维成分测定以及酶解发酵产乙醇的相关研究。结果表明，所用干海带渣中纤维素含量达 28.3%，经稀酸预处理的海带渣酶解后还原糖浓度为31.1 mg/mL，经酵母发酵后产乙醇浓度约1.01%L/L，均高于相同条件下的碱预处理；对海带渣进行同步糖化发酵比对其进行分步糖化发酵乙醇产率高17%以上；在海带渣同步糖化发酵中，添加南极低温纤维素酶QP7与常温纤维素酶进行复配降解时，乙醇产量提高21%以上，具有明显的改良效果。通过实验初步确立了海带渣稀酸预处理方法和同步糖化发酵的方式，为进一步实验作重要基础。本实验中单独使用低温QP7酶进行同步糖化发酵时乙醇产量偏低，后续实验中有待进一步深入研究。

海带类海藻植物在我国沿海的分布非常广泛，目前我国海带年产量占了全球年产量的 95%[2]；然而海带工业生产中，以干物质计，其利用率仅约30%，有逾50%的成分成为废弃物[11]，这不仅浪费资源，也带来环境的污染，因此对海带渣等海藻工业废弃物进行研究意义重大。相比陆生农作物废弃秸秆等，虽然对海带渣等海藻工业废弃物产燃料乙醇的相关研究起步较晚，报道不多，但意义同样重大，应用前景广阔。而且与秸秆等相比，由于结构上的差异，海带渣更易降解产糖。本实验中对照样玉米秸秆纤维素含量为 33.6%，高于海带渣的28.3%，但相同条件下海带渣降解更彻底，其降解产糖量和发酵产乙醇浓度均明显高于秸秆。因此，将海带渣作为产燃料乙醇原料具有独特的优势和重要的意义。

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