中药金叶败毒制剂对鼠巨细胞病毒感染后的细胞病变及热休克蛋白70的表达影响

崔文华 底建敏 张国华 陈冀英

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)在妊娠期活动性感染可经宫内传播，可导致流产、胎儿畸形、死胎、胎儿宫内发育迟缓、先天性智力低下、听力损害、小头畸形、颅内钙化、脉络膜视网膜炎以及出生后神经系统发育落后等［1，2］。治疗孕期HCMV活动性感染是阻断HCMV宫内传播，预防HCMV宫内感染重要手段。但目前缺乏安全有效治疗药物。我们研究证实：JYBD具有抗HCMV和豚鼠巨细胞病毒作用［3，4］，因它为中药复方制剂，成分较多，药理作用复杂，作用靶点多，抗病毒分子机制不明。小鼠巨细胞病毒(MCMV)与HCMV生物学特征相似，故通过研究，JYBD对MCMV感染及影响因素，来推测JYBD对HCMV致病分子机制，中药JYBD制剂是否影响MCMV感染细胞的病变情况及HSP70表达，是否通过影响MCMV感染细胞HSP70表达而发挥抗病毒作用，我们通过选体外实验方法，观察中药JYBD制剂对MCMV感染细胞的病变情况及HSP70表达影响。以探讨中药JYBD制剂抗病毒分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒与细胞：病毒MCMV Smith株购于美国典型培养物保藏中心，按常规方法滴定，并测定半数细胞感染剂量(TCID50)。小鼠胚肺细胞NIH3T3株购于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，细胞按常规方法培养传代。

1.1.2 实验药物：中药JYBD注射剂，20 ml/Amp，含生药量1 g/ml，用0.22μm微孔滤器过滤除菌，4℃保存备用。阳性对照药物：更昔洛韦(GCV)粉针剂，50 ml/支。

1.1.3 主要试剂：高糖MDEM培养基为美国Gibico公司产品，鼠抗鼠HSP70 McAb为美国Santa Cruz公司产品，生物素化山羊抗鼠IgG及SP试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑盐(MTT)均购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒毒力测定：常规测定MCMV Smith株TCID50=10-5。

1.2.2 药物毒性试验：用MTT、细胞病变法测JYBD、GCV最大无毒浓度TD0，两种方法测得结果一致，JYBD TD0为5 mg/ml，GCVTD0为100 μg/ml。

1.2.3 NIH/3T3细胞培养：将NIH/3T3细胞以1.00×106/ml接种25ml培养瓶，培养成功后，留取约1.00×106/ml细胞于培养瓶内，置37℃ 5%CO2恒温培养箱继续培养，其余细胞待接种入十二孔板。

1.2.4 实验步骤：将NIH/3T3细胞分别植于7个铺有盖玻片12孔板，每一12孔板分别设有正常细胞组、病毒感染组、JYBD组、GCV组。7个时相种7个12孔板细胞，待细胞长至60%融合，倾掉培养液，4组均接种100 TCI D50攻击量MCMV Smith株50μl/孔，置37℃ 5%CO2恒温培养箱内，病毒吸附2 h，正常细胞组、病毒感染组换新维持液，JYBD组，弃病毒液，加入TD0JYBD，更GCV组弃病毒液，加入TD0更昔洛韦，均分别作用12、24、72、120 h，收获细胞，待检测。阴性对照组操作方法同病毒感染组、JYBD组、GCV组，用0.01 mol/L PBS代替一抗来检测HSP70。

1.2.5 HSP70检测采用免疫组化法：每次实验均设置阳性和阴性对照。

1.2.6 倒置显微镜下观察细胞形态学变化。

1.2.7 图像分析：采用HMIAS高清晰度彩色医学图文分析系统对图像进行分析。

1.3 统计学分析应用SAS 8.1统计软件，计量资料以±s表示，采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验特异性 每次试验阴性对照均呈阴性结果(细胞内未见阳性着色)，阳性对照组细胞内出现棕黄色阳性信号，说明实验特异性良好。

2.2 细胞病变情况 病毒感染组：MCMV感染12 h，HSP70表达开始增高时，25%细胞胞浆发生较明显的空泡变性;感染24 h，HSP70继续升高时，50%左右胞浆发生明显的空泡变性，感染72 h HSP70表达继续升高，75%空泡变性以胞核周围为主;感染120 h，HSP70表达达高峰时，85%细胞出现病变，部分细胞变圆肿胀，发生病变变圆细胞出现萎缩改变，部分形态正常细胞胞浆出现严重的空泡变性。说明MCMV感染时，HSP70的表达强度与细胞病变程度相关。与病毒感染组比较，JYBD组：12～72 h细胞胞浆空泡变性程度均减轻，未观察到病变变圆细胞，120 h观察到出现病变变圆细胞，而部分正常细胞胞浆空泡变性程度减轻。与JYBD组比较，GCV组细胞胞浆空泡变性程度与之相当，但120 h未观察到病变变圆细胞。见图1～4，表 1。

表1 不同处理组细胞病变的程度

图1 正常的小鼠胚肺细胞(正常×100)

图2 MCMV感染小鼠胚肺细胞出现50%病变(正常×100)

图3 免疫组化检测加入金叶败毒120h热休克蛋白70表达情况(免疫组化×200)

图4 免疫组化检测加入更昔洛韦120h热休克蛋白70表达情况(免疫组化×200)

2.3 阳性信号在细胞各部位表达情况 正常细胞对照组：较多细胞核内为淡棕色细颗粒，个别细胞核周围、胞浆可见淡棕色阳性信号。核内为淡棕色细颗粒，个别细胞核周围、胞浆可见淡棕色阳性信号。病毒感染组：感染12 h细胞浆核表达;感染24 h主要在细胞核周围表达;感染72 h主要在胞核表达，以病变细胞为主;感染120 h病变细胞内均有大量HSP70表达。JYBD组：12 h HSP70主要在胞核内表达，24 h主要在细胞核周围表达，72 h在细胞核、浆内表达，120 h主要在细胞浆、核周表达。GCV组：12 h主要在细胞浆表达，24 h主要在细胞核周围表达，72 h主要在细胞核表达，120 h在细胞核周围表达。

2.4 HSP70各时相表达强度 病毒感染组：12 h开始上升，72 h继续上升，120 h达高峰。与正常细胞组比较，各时相HSP70表达强度差异有统计学意义(P＜0.05)。JYBD组：12 h HSP70表达增强，24 h稍降低，72 h变为逐渐上升，120 h达最高点。与正常细胞组比较，各时相HSP70表达强度差异有统计学意义(P＜0.05);与病毒组比较，12、24 h HSP70表达强度差异有统计学意义(P＜0.05)。GCV组：12 h HSP70表达增强，24 h表达最低，72～120 h变为逐渐升高，与正常细胞组比较，各时相HSP70表达强度差异有统计学意义(均 P＜0.05);与病毒组比较，12、24 h 2个时相HSP70表达强度差异有统计学意义(P＜0.05);与JYBD组比较，各时相HSP70表达强度差异均异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 不同处理组HSP70表达强度±s

表2 不同处理组HSP70表达强度±s

注：与正常细胞组比较，*P＜0.05;与病毒感染组比较，#P＜0.05

12 0.0607±0.0030 0.1597±0.0147* 0.2393±0.0171*#0.2294±0.0303*#24 0.0606±0.0005 0.1204±0.0202* 0.1422±0.0059*#0.1592±0.0239*#72 0.0642±0.0041 0.1865±0.0273* 0.1867±0.0489* 0.23538±0.02088*120 0.0628±0.0031 0.3135±0.0443* 0.2527±0.0367* 0.24972±0.02664*

3 讨论

3.1 探讨金叶败毒抗MCMV感染价值 目前，HCMV感染非常普遍，孕妇易发生活动性感染导致宫内传播，HCMV宫内感染可以导致流产、早产、死胎、宫内发育迟缓、感音神经性耳聋、认知障碍、出生后神经系统发育落后等不良后果［5-7］。GCV具有良好的抗HCMV作用，但孕期使用可能引起胎儿唇裂、无眼或小眼症等［8-10］，孕妇禁用。因此，目前临床尚无治疗孕期HCMV活动性感染的药物。JYBD是一种纯中药制剂，它的四种成分金银花、鱼腥草、大青叶、蒲公英是祖国医学常见清热解毒药物，已证实：该药具有抗HCMV和豚鼠巨细胞病毒作用且生殖毒性实验结果阴性［4］，故有望成为治疗孕期HCMV感染药物。

3.2 JYBD对MCMV感染细胞的细胞病变影响 本实验显示，与病毒感染组比较，JYBD组：12～72 h细胞胞浆空泡变性程度均减轻，未观察到病变变圆细胞，120 h观察到出现病变变圆细胞，可能与JYBD作用逐渐减弱有关，而部分正常细胞胞浆空泡变性程度减轻。与JYBD组比较，GCV组细胞胞浆空泡变性程度与之相当，但120 h未观察到病变变圆细胞，表明，GCV比JYBD持续作用更长，对MCMV感染抑制时间更长，由此推测，二者对MCMV感染均有抑制作用。

3.3 JYBD对MCMV感染细胞HSP70表达影响 从细胞病变程度来看，与病毒组比较，金叶败毒组由于HSP70在胞核内出现时间早，持续时间长，表达水平高，细胞病变程度减轻，但当HSP70表达水平下降后(120 h)出现细胞病变，从HSP70表达强度分析，与病毒对照组比较，加入金叶败毒和GCV，HSP70表达强度进一步增高，其中，12～24 h表达强度均显著高于病毒感染组，但72 h后增强作用减弱。从HSP70核浆移位现象看，与病毒组比较，金叶败毒组HSP70核浆移位现象提前，12 h HSP70已明显进入细胞核，且在细胞核内持续时间延长，(病毒组12 h主要在细胞浆)，120 h部分正常细胞HSP70已移位至细胞浆、胞核周围，病变细胞在胞核表达。与金叶败毒组比较，GCV组HSP70在细胞核内持续时间短。

上述结果提示，JYBD通过影响HSP70表达来抑制MCMV致细胞病变作用，提示，JYBD增强病毒感染细胞中HSP70表达，可能是其抗MCMV分子机制。

1 王新，皮培湘，朱付凡，等.孕妇HCMV感染及妊娠结局分析.中国优生与遗传杂志，2004，12：82-83.

2 Franca CM，Mugayarl R.Intrauterine infections：aliterature review.Spec Care Dentist，2004，24：250-253.

3 张宏秀，闻良珍.中药“金叶败毒制剂”对巨细胞病毒体外抑制作用的研究.中国优生与遗传杂志，2004，12：85-86.

4 陈素华，熊金文，邢玮.金叶败毒治疗孕早期豚鼠巨细胞病毒感染的研究.医药导报，2004，23：1-3.

5 Abbim，Bides S，Caroppo S，etal.A wider role for congenital cytomegalovirus infection in sensorneuralhearing loss.Pedia Infect Dis J，2003，22：39-42.

6 Iwasaki S，Yamashitam E，Maede M，etal.Audiological outcome of infants with congenital cytomegalovirus infection in a prospective study.Audiol Neurootol，2006，12：31-36.

7 Dollard SC，Grosse SD，Ross DS.New estimates of the prevalence of neurological and sensory sequelae and mortality associated with congenital cytomegalovirus infection.Rev Med Virol，2007，17：355-363.

8 Crumpackerc S.Ganciclovir.N Engl J Med，1996，335：721-729.

9 Puliyandad P，Silverman NS，Lehman D，etal.Successful use of oral ganciclovir for the treatment ofintrauterine cytomegalovirus infection in a renal allograft recipient.Transpl InfectDis，2005，7：71-74.

10 戴德银主编.实用新药特药手册.第2版.北京：人民军医出版社，1997.267.