食管癌可溶性抗原和超抗原构建肿瘤疫苗的免疫活性成分分析

马淑芹 张庆波 李博 幺文博 胡万宁 杨雷 王宗会 王静怡

癌症严重威胁着人类的生命健康，食管癌是其之一，我国食管癌病死率为15.02/10万，在我国居恶性肿瘤的第四位。传统的癌症治疗方法是手术、放疗和化疗，但均存在有一定的缺点和不足，由于肿瘤本身的侵袭和复发的生物学系特性，使治疗效果受限。随着免疫学理论和分子生物学知识的不断发展和突破，肿瘤生物疗法成为控制和消除肿瘤的新途径，肿瘤免疫疗法是肿瘤生物疗法的重要组成部分。本研究应用超抗原金葡素C型(staphlococcal enterotoxin，SEC)联合食管癌肿瘤可溶性抗原(tumor soluble antigen，TSA)构建肿瘤疫苗，刺激PBMC增值，诱导产生细胞毒性T细胞(cyctotoxic T lymphocyte，CTL)，对肿瘤细胞进行杀伤，并对其有效成分进行分析，以探讨其治疗癌症的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂：PBMC分离液(天津TBD公司)，RPMI-1640(Gibco公司)，超抗原SEC(购于沈阳协和集团)，CCK-8(武汉碧云天公司)，异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CD19/CD3/CD4/CD8(美国BD公司)，ELISA试剂盒(美国R＆D公司)，3H-Tdr(中科院原子能所)。

1.1.2 肿瘤细胞系：人食管癌细胞株Eca109，宫颈癌细胞株Hela，由河北联合大学医学实验中心提供。

1.2 方法

1.2.1 PBMC的分离：取正常献血者外周血10ml，肝素抗凝，用Ficoll细胞分离液(比重：1.077)分离PBMC。用生理盐水洗细胞三次，计数细胞数，置于含10%人AB型血清的RPMI-1640培养基。

1.2.2 食管癌抗原的制备：培养食管癌细胞，胰酶消化，PBS洗细胞一次(1 000 r/min)，加入3mol/L KCl(破碎细胞)，4℃摇床振摇过夜，12 000 r/min离心，取上清，透析，离心，取上清加入等量4 mmol/L硫酸铵沉淀蛋白质，透析，去除硫酸铵，用紫外分光光度计280 nm波长下测定蛋白含量，作为肿瘤可溶性抗原(TSA)。经0.45μm微孔滤膜过滤除菌，保存 -80℃备用。

1.2.3 PBNC增殖的测定：实验分4组：A组：PBMC，B组：SEC+PBMC，C 组：TSA+PBMC，D 组：肿瘤疫苗(SEC+TSA)+PBMC，SEC 浓度0.1 ng/ml，TSA 浓度50 μg/ml。用RPMI-1640培养液调细胞浓度为106/ml，接种于96孔板，每孔100μl，每组设3复孔。分别培养24 h、48 h、72 h、96 h，CCK-8比色法测定细胞增殖。

1.2.4 细胞表型分析：RPMI-1640培养液调PBMC浓度为106/ml，接种于6孔板，每孔2 ml。按上述分组，每组4孔，培养第6天，每组各孔分别加入FITC标记的CD3，CD4，CD8单克隆抗体，FCM检测。

1.2.5 细胞毒活性检测：4组增值的PBMC作为效应细胞(细胞浓度为2×106/ml)，分别作用于靶细胞Eca109(1×105)和Hela(1×105)，效∶靶=20∶1，另设效应细胞对照组和靶细胞对照组，每组3复孔。培养24 h后，CCK-8法测各组效应细胞对靶细胞的杀伤率。

细胞杀伤率(%)=［1-(实验组OD值-效应细胞组OD值)］/靶细胞组OD值 ×100%。

1.2.6 食管癌抗原有效成分分析：提取食管癌的细胞膜抗原(mAg)、热休克蛋白 70(HSP70)、DNA、RNA和细胞内多肽(Peptides)，并用于诱导外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)增殖，培养 6 d，用 3H-Tdr掺入法测定细胞增值。

将分离的PBMC置于含10%人AB型血清的RPMI-1640培养基中，调细胞浓度1×106/ml，置于24孔培养板中，每孔2 ml，将上述各成分按 20，10，5，2.5，1.25，0.625，0.3125，0.15μg/ml的终浓度加入到 PBMC中，37℃，5%CO2的环境中培养，3 d后换液，加入新鲜培养液和相同浓度的抗原，混匀后，转入96孔平底培养板(每孔200μl，设3个平行孔)，继续培养3 d，收获细胞前16～18 h加入0.5μCi/ml的3H-Tdr，用细胞收集器收集细胞于玻璃硝酸纤维滤纸上，β计数仪测定cpm数。

1.3 统计学分析 应用SPSS 16.0统计软件，多组间数据比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组细胞增殖分析 在72h之前，4组淋巴细胞增殖能力随时间的增加而增强，各实验组均于72 h时细胞增殖达高峰;但到96 h时，细胞增殖趋势开始下降。同一时间点，4组细胞增殖能力也不同，经食管癌肿瘤疫苗刺激的D组与A、B、C组比较，细胞增殖活性最高，于72 h达到高峰(P＜0.05)。见图1。

图1 4组细胞增殖分析

2.2 荧光染色分析 4组细胞培养3 d后，用荧光抗体染色，进行细胞表型分析，4组CD3均表达为阳性，表明所诱导的细胞为T细胞。对照组A的CD8只有25.44%，而B、C、D 3组较之明显升高(P＜0.05)，D组诱导的CD8+最高，为42.10%，说明所诱导的细胞为CD8+CTL细胞。见表1。

表1 细胞表型分析%，±s

表1 细胞表型分析%，±s

注：与A组比较，*P＜0.05

组 C组 81.24±1.84 43.19±0.91 35.30±2.94*D组 85.24±1.90 46.55±2.80 42.10±3.94*

2.3 细胞毒活性检测 经肿瘤疫苗(TSA+SEC)刺激的D组诱导产生的CTLs对靶细胞Eca109杀伤活性显著高于A组(P＜0.01)，效应细胞对Eca109的杀伤率明显高于对Hela的杀伤率(P＜0.01)，表明D组具有高效、特异性的杀伤作用。见表2。

表2 效应细胞对靶细胞系的杀伤率比较%，±s

表2 效应细胞对靶细胞系的杀伤率比较%，±s

注：与D组比较，*P ＜0.01;与Eca109比较，*P ＜0.01

C组 82.6±3.9 80.2±2.7 D组 96.9±7.5 84.7±6.6*

2.4 食管癌抗原免疫活性成份分析 食管癌可溶性抗原能够诱导PBMC增值，表明TSA具有免疫原性。其主要活性成分是细胞内多肽、细胞膜蛋白，其他成分则不具有免疫原性。见表3。

3 讨论

肿瘤抗原的存在是机体识别肿瘤并激活免疫系统的物质性低下，不被免疫系统识别，不能有效刺激机体免疫应答，使肿瘤处于免疫逃逸状态［1］。近年来，提高肿瘤疫苗免疫原性的方法有很多，如增强MHC-肽复合物的稳定性，增强共刺激信号的表达、使用免疫佐剂、超抗原等。金葡菌肠毒素(staphlococcal enterotoxin，SE)是一种具有高度生物活性的蛋白质，是目前研究较多的细菌性超抗原(super antigen，SAg)，SE能同时结合主要组织相容性复合体Ⅱ(MHCⅡ)和T细胞识别受体(TCR)而连接抗原递呈细胞(APC)，因其不需要APC的内处理，在MHCⅡ的抗原结合槽的外侧直接与之特异性结合，并通过结合T细胞受体Vβ片段(TCRVβ)的不同片段高效的激活T细胞，促使分泌大量及多种细胞因子［2，3］，对肿瘤细胞产生直接和间接的杀伤和抑制作用，实验研究效果较好［4，5］，但单纯应用超抗原SE没有靶向作用［6］。本研究将肿瘤可溶性抗原与超抗原SEC联合作用T细胞，可以保证肿瘤抗原被有效摄取提呈，且可提高共刺激信号，诱导针对肿瘤抗原的CTL应答。实验研究结果发现，肿瘤全溶物与超抗原SEC联合应用具有更为强大的活化效应细胞的能力，对靶细胞的杀伤率更为明显，显示出一定的抗肿瘤免疫治疗应用前景。

由食管癌可溶性抗原和金葡菌超抗原构建的肿瘤疫苗，能显著地诱导PBMC活化、增殖，产生高效、特异的CTL，具有特异性的免疫活性成分是细胞膜抗原和细胞内多肽。此研究为肿瘤疫苗的构建奠定了理论基础。基础，由于肿瘤细胞缺乏一种或多种抗原成分，导致其免疫原

表3 肿瘤可溶性抗原免疫活性成分分析

1 Smyth MJ，Godfrey DI，Trapani JA.A fresh look at tumor immunosurveillance and immunotherapy.Nat Immunol，2001，2：293-299.

2 Wen R，Cole GA，Surman S，etal.Major histocompatibility complex classⅡ-associated peptides control the presentation of bacterial superantigens to T cell.JExp Med，1996，183：1083-1092.

3 Woodland DL，Wen R，Blackman MA.Why do superantigens care about peptides?Immunol Today，1997，18：18-22.

4 Perabo FG，Willen PL，Wirger A，etal.Preclinical evaluation of superantigen(staphylococcal enterotoxin B)in the intravesical immunotherapy of Superficial bladder cancer.Int JCancer，2005，115：591-598.

5 Thamm DH，Kurzman ID，Macewen EG，etal.IntralesionaI lipid-complexed cytokine/Superantigen immunogene therapy for spontaneous canine turnors.Cancer Immunol Immunother，2003，52：473-480.

6 韩从辉，郑宝钟，田军，等.超抗原诱导杀伤性T细胞体内外对膀胱肿瘤的杀伤作用研究.中华肿瘤杂志，2000，23：392.