腹腔内注射腺苷对大鼠中缝背核c-fos表达的影响

付立波 (长春师范大学生命科学学院，吉林 长春 130032)

在缺血、缺氧和血流灌注不足的情况下，大脑中的腺苷浓度迅速上升，内源性腺苷对代谢增加和能量不足所引起的组织损伤具有保护作用，对睡眠具有促进作用。抑制中缝背核(DRN)的5-羟色胺(5-HT)能神经元，5-HT释放减少，c-fos蛋白表达增加，也能促进睡眠。许多睡眠因子，如IL-1，褪黑素等都能促进睡眠，使CNS内c-fos蛋白及c-fos mRNA表达水平提高〔1～3〕。c-fos诱导及显示技术在神经系统形态和功能相结合的研究中受到了广泛的应用。本实验拟明确腺苷对大鼠中缝背核c-fos表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 采用200～250 g雄性纯种Wistar大鼠20只，由吉林大学动物实验中心提供，每天对大鼠进行3次抓拿训练，进行1 w的训练，以减少大鼠对抓拿反应的影响。随机分三组，每组6只(n=6)，即生理盐水组(对照组)、腺苷组和茶碱组。

1.2 实验药品 腺苷、茶碱、生理盐水、戊巴比妥钠、4%多聚甲醛0.1 mol/L PBS 500 ml、石蜡、LKBⅢ型超薄切片机、氧化酶阻断剂、非免疫动物血清、氧化酶阻断溶液、兔抗人c-fos多克隆抗体、50 μl生物素、50 μl链霉菌抗生物素中性树胶、苏木素、梯度酒精、二甲苯、新配制的DAB溶液，所有药品均由Sigma公司提供。

1.3 装片制备 将分组后的大鼠分别注入药剂，注入时间为1 h，时间一到，立即将大鼠用戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉，断头，随即开胸，经左心室灌注生理盐水100 ml，继以灌注含4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS 500 ml进行固定，60 min后取出脑组织，置于含4%多聚甲醛的PBS(0.1 mol/L)中后固定2天，取相应中缝背核的脑组织块，用石蜡包埋，修块，并用LKBⅢ型超薄切片机切成5～8 μm切片。

1.4 Fos免疫组织化学染色(ABC法) 将石蜡切片脱蜡和水化，之后用PBS(0.01 mol/L，pH7.4)冲洗3次，每次3 min。接着在每张切片上加一滴过氧化酶阻断剂(试剂A液)，即用抗原修复液对组织抗原进行修复，室温下孵育15 min。取出切片，每张切片加50μl过氧化酶阻断溶液(抗体)，室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3 min。甩去PBS液，每张切片加50 μl正常非免疫动物血清(试剂B液)，室温下孵育3 min。除去血清，每张切片加50 μl的兔抗人c-fos多克隆抗体，4℃过夜。PBS冲洗3次，每次3～5 min。除去PBS液，每张切片加50 μl生物素标记的第二抗体(试剂C)，室温下孵育10 min。PBS冲洗3次，每次3 min。除去PBS液，每张切片加50 μl链霉菌抗生物素-过氧化酶溶液(试剂D)，室温下孵育10 min。PBS冲洗3次，每次3 min。除去PBS液，每张切片加100 μl新配制的 DAB溶液，观察3～10 min。自来水冲洗，苏木素复染，PBS冲洗返蓝。切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.5 结果判断及统计学处理 细胞质中有红色颗粒者为阳性细胞，每只大鼠随机取5张切片，在400倍镜下计数核团内一个视野的Fos免疫反应阳性神经元(fos-like)的数量，取其平均数。在观察切片时，每张切片计数3个高倍镜视野，计算平均百分数及标准数，结果以±s表示，两组间均数用配对样品t检验。

2 结果

大鼠腹腔内注入腺苷后，中缝背核内c-fos蛋白表达为3.75% ±0.95%，而对照组c-fos蛋白表达为0.40% ±0.30%，二者相比差异有统计学意义(P＜0.05);腹腔内注入茶碱后中缝背核内c-fos蛋白表达为1.56% ±0.45%，与对照组c-fos蛋白表达无显著差异(P＞0.05);腹腔内注入腺苷组c-fos蛋白表达与腹腔内注入茶碱组c-fos蛋白表达差异有统计学意义(P＜0.05)，表明大鼠腹腔内注入腺苷后c-fos蛋白表达明显增加，注入茶碱后c-fos蛋白表达增加不明显，即腺苷促进c-fos蛋白表达。见图1。

图1 大鼠腹腔分别注射腺苷、茶碱及生理盐水中缝背核内c-fos蛋白的表达(DAB，×400)

3 讨论

腺苷是一种抑制性的神经递质，内生腺苷在外周可抑制控制肌肉运动的神经元释放乙酰胆碱，抑制交感神经释放去甲肾上腺素。其对中枢神经系统的作用包括:调节神经递质如谷氨酸、多巴胺、5-羟色氨、去甲肾上腺素、GABA等的释放和降解，增强GABA的抑制功能，抑制大脑皮层中谷氨酸及多巴胺的兴奋等。另外，多例动物实验〔4～6〕已证实腺苷及其类似物还可以产生镇静作用及诱发睡眠。腺苷促进睡眠作用主要是由腺苷受体A1R、A2AR介导的〔7〕。腺苷A1R被腺苷激活后抑制Ca2+内流，开放钾通道，增加K+的电导从而减少了兴奋性氨基酸的释放，限制了膜的去极化，抑制了神经元的兴奋，导致抑制效应，有时A2AR也可能参与这个过程。根据Li等〔8〕的研究报道可以知道腺苷通过与腺苷A1受体结合，经过钙离子依赖的蛋白激酶C转导途径抑制GABA神经元，GABA的释放减少，c-fos蛋白表达增加，促进睡眠。腺苷与A2A受体结合，可兴奋神经元。腺苷是内源性促睡眠物质之一，具有睡眠调节作用，微透析研究发现前列腺素D2能升高睡眠促进区细胞外腺苷的水平，腺苷与A2AR结合能促进c-fos蛋白表达，可介导前列腺素D2的睡眠诱导作用〔9〕。中缝背核是中枢神经系统中富含5-HT能神经元的一个重要核团，是参与睡眠调节的重要结构。中缝背核5-HT能神经元的活动和释放5-HT积极地参与睡眠和觉醒的调节。5-HT是中缝背核内影响睡眠的因子，是一种重要的神经递质，参与睡眠调节〔10〕。电损毁中缝背核可导致动物失眠，适当电刺激可使清醒动物立刻进入睡眠状态。抑制5-HT能神经元的活动，5-HT释放量减少，中缝背核内c-fos蛋白表达增加，可以促进睡眠。本实验大鼠腹腔内注射腺苷后，中缝背核内c-fos蛋白表达也增加，且腺苷非特异受体拮抗剂茶碱具有促进觉醒的作用，为腺苷具有促进睡眠的作用提供了依据。

腺苷在中枢神经系统的作用广泛，目前研究发现，它还与记忆和衰老、癫痫、痛觉调质、帕金森症、精神病样的行为、脑内奖赏系统、痛觉调节、抗焦虑等效应有一定相关性〔11〕。

1 霍 艳，李经菜，江 岩，等.褪黑素对小鼠视交叉上核c-fos基因表达的影响〔J〕.中国药理通报，2000;16(3):261-4.

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3 付立波，王学斌，刘凤莲.腺苷对大鼠缰核神经元自发放电活动及cfos蛋白表达的影响〔J〕.中国免疫学杂志，2010;26(2):141-5.

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5 Basheer R，Halldner L，Alanko L，et al.Opposite changes in adenosine AL and A2A receptor mRNA in the rat following sleep deprivation〔J〕.Neu-roscience，2001;12(8):157-80.

6 Huston JP，Haas HL，Boix F，et al.Extracellular adenosine levels in neoseriatum and hippocampal during rest and activity periods of rats〔J〕.Neuroscience，1996;73(1):99-107.

7 Rebo N，Rpdrigues RJ，Lopes LV，et al.AdenosineA(1)and A(2A)receptors are coexpressed in pyramidal neurons and colocalized in glutamatergic nerve terminals of the rat hippocampus〔J〕.Neuroscience，2005;133(1):79-83.

8 Li Hui，Wu Le，Li YQ.Adeonsine suppresses GABAA receptor-mediated responses in rat sacral dorsal commissural neurons〔J〕.Autonomic Neurosci:Basic Clin，2004;111(2):1-79.

9 Hayaishi O.Prostaglandins and sleep〔J〕.Nippon Rinsho，1998;56(2):285-9.

10 Maitre M，Cielsielski R，Lehman NE，et al.Protective effects of adenosine and nicotinemide against audio genic seizure〔J〕.Biochenmacol，1974;23(20):2807-16.

11 Onoe H，Ueno R，Fujita L，et al.Prostaglandin D2，a cerebaral sleep inducing substance in monkeys〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1998;5(11):4082-6.