高脂血症对脑缺血大鼠模型脑皮质MMP-2表达和神经元凋亡的影响

张振强 宋军营 贾亚泉 李澎涛 潘彦舒 (河南中医学院，河南 郑州 4500046)

缺血性脑病成为严重危害人类健康的慢性流行性疾病之一，其发病机制较为复杂。近年研究发现，在脑缺血后的几个小时内，缺血半暗带或梗死区周围的神经元死亡主要以凋亡性死亡为主，这提示了脑缺血损伤与细胞凋亡密切相关〔1〕。因此，对脑缺血后神经细胞凋亡机制及基于抗凋亡为靶点的抗脑缺血的研究成为国内外研究的热点。Bcl-2蛋白家族主要参与线粒体引起的凋亡途径，Bcl-2和Bax参与了脑出血后神经细胞的凋亡。Bcl-2通过阻断细胞凋亡而促进细胞存活，维持细胞生存;而Bax与 Bcl-2功能相反，则诱导细胞凋亡。因此，Bcl-2与Bax的比值变化决定细胞的凋亡与生存〔2〕。近年来，基质金属酶(MMPs)，尤其是MMP-2，在缺氧缺血性脑损伤及脑水肿中所起的作用，逐渐被人们所关注。MMP-2即72kDa IV型胶原酶，由肥大的星形细胞、星形胶质细胞、缺血的内皮细胞和巨噬细胞等合成和分泌。其过度表达不仅能够引起微血管的损失，而且破坏神经细胞赖以生存的环境，并对炎症因子发挥正反馈作用，使脑缺血后炎症发生，加速神经细胞凋亡〔3〕。高脂血症和高黏滞血症是缺血性心脑血管病的重要原因。因此，本文在高脂血症的病理基础上探讨脑缺血后神经细胞凋亡及相关基因表达的机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组 实验动物随机分为正常组(C1)、高脂对照组(H1)、假手术组(C2)、高脂假手术组(H2)、单纯脑缺血组(I3和I7)、复合脑缺血组(H+I3和H+I7)。其中对照组与假手术组每组10只;模型组设两个时间组，分别为脑缺血手术后3 d(I3和H+I3)和7 d(I7和H+I7)，每个时间点15只动物(按预实验死亡率25%计，保证造模成功后取材的动物数)。

1.2 实验动物模型制备 健康雄性SPF级Wistar大鼠，体重280～300 g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号为:SCXK(京)2007-0001，质量合格证号:0243109。高脂血症组大鼠每天以高脂饲料(组成:3.5%胆固醇、10%猪油、0.2%丙硫氧嘧啶、0.5%胆酸钠、5%白糖、80.8%基础饲料)喂养，正常对照组以清洁级正常饲料喂养。

大鼠以10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血模型(MCAO)。动物仰卧固定，颈部正中切口，分离并暴露右侧颈总动脉及颈内、外动脉，结扎颈总动脉及颈外动脉根部，由颈总动脉近分叉处剪一小口插入尼龙线(长50 mm，直径0.26 mm，18 mm处作标记)，插入长度约(18±0.5)mm时感到有轻微阻力时停止，扎紧并固定插线，缝合皮肤。

模型制备成功后，每组各取动物5只，以10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，背位固定于鼠板上，腹主动脉取血5 ml，静置 30 min，以 3 000 r/min，离心 15 min，取上清液，-20℃冰箱冷冻备用。每组再各取动物5只，以10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，背位固定于鼠板上，剪开胸腔，暴露出心脏，先用手术剪剪开右心耳，再用100 ml注射器进入左心室插进主动脉，先灌注生理盐水150 ml左右，再灌注多聚甲醛400 ml左右;断头取出全脑，脑组织经过常规脱水透明，制备蜡块，备用。

1.3 神经功能评分 对造模大鼠苏醒后和取材前分别进行神经功能评分。评分标准参照Longa的5级评分方法评定动物的神经系统功能。0级:无体征;1级:动物左侧前肢不能完全伸展;2级:左前肤瘫痪，出现追尾现象;3级:肢体瘫痪，不能站立;4级:动物昏迷，无自主性活动。评分为1级到3级的动物为造模成功，入组，于相应时间点再次评分后取材。计算方法:以各组动物造模苏醒时、取材前两次评分进行组间比较。

1.4 免疫组化 脑组织片按上面的时间步骤进行脱蜡脱水;3%H2O237℃孵育 10 min，阻断灭活内源性过氧化物酶0.01 mmol/L枸橼酸缓冲液微波修复抗原12 min自然冷却20 min以上;正常羊血清工作液封闭，37℃ 20 min，吸去多余液体，勿洗。兔多克隆抗体 MMP-2(1∶200)，Bcl-2(1∶200)和Bax(1∶100)4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3×5 min(用 PBS缓冲液代替一抗作阴性对照);生物素标记二抗，37℃孵育60 min，HRP标记链亲和素孵育60 min，DAB显色液反应染色。苏木精染核，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。所有结果在10倍，40倍物镜下观察，采用40倍物镜拍照。采用Lmageproplus 6.0图像分析系统检测平均光密度值。

1.5 统计学分析 采用SPSS16.0统计软件分析，实验数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 神经功能评分结果 见表1。对各模型组造模苏醒后及3、7 d取材前评分进行比较，各组间没有明显差异(P＞0.05);复合脑缺血组与单纯脑缺血组在造模苏醒后和3、7 d取材前评分差值比较，3 d时组间没有明显差别(P＞0.05)，7 d时组间比较差值增大，差异显著(P＜0.05)。

表1 各组造模苏醒后和相应时间点取材前的神经功能评分差异(± s，n=5)

表1 各组造模苏醒后和相应时间点取材前的神经功能评分差异(± s，n=5)

与单纯脑3 d组相比较:1)P＜0.05

组别 造模苏醒后评分 取材前评分 差值C2 0 0 0 I3 2.00±0.17 1.83±0.11 0.16±0.11 I7 1.92±0.15 1.67±0.14 0.25±0.13 H2 0 0 0 H+I3 2.00±0.17 1.58±0.15 0.41±0.15 H+I7 2.08±0.19 1.42±0.15 0.67±0.141)

图1 大鼠脑皮质梗死边缘区MMP-2表达(×400)

2.2 高脂血症病理条件下脑缺血组织中MMP-2的表达变化与正常(21.77±1.51)及假手术组(30.90±1.94)相比，MMP-2在单纯脑缺血组(85.93±2.47)、(70.87±3.07)、高脂血症组(44.32±1.99)、(54.61±4.02)和复合脑缺血组(80.82±2.95)、(99.68±2.54)的表达显著增多(P＜0.05)，与高脂血症及高脂血症假手术相比，复合脑缺血组的MMP-2的表达也是明显增多的(P＜0.05)，且MMP-2在复合脑缺血7 d组的表达显著高于在单纯脑缺血组的表达。这些结果表明高脂血症的病理条件可能对MMP-2的表达有影响，见图1。

2.3 高脂血症病理条件下脑缺血组织中Bcl-2和Bax的表达变化 见表2和图2。假手术的Bcl-2和Bax表达量都很少，但是，Bcl-2和Bax在单纯脑缺血、高脂血症和复合脑缺血组均有表达，而且差异显著(P＜0.05)。与单纯脑缺血相比，复合脑缺血组的Bax的表达显著下降(P＜0.01)，Bcl-2的下降幅度小于Bax，复合脑缺血7 d尤为显著。因此，Bcl-2/Bax比值升高，差异显著(P＜0.05)。这些结果说明脑缺血后神经细胞的凋亡程度主要由Bcl-2/Bax比值变化决定，高脂血症对脑缺血后神经细胞的凋亡有一定的影响作用。

表2 大鼠脑皮质梗死边缘区Bcl-2和Bax的蛋白表达(± s，n=5)

表2 大鼠脑皮质梗死边缘区Bcl-2和Bax的蛋白表达(± s，n=5)

与C2组相比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01)，与 I3组相比较:3)P＜0.05，4)P＜0.01;与I7组比较:5)P ＜0.05，6)P ＜0.01;与 H2组比较:7)P ＜0.05，8)P ＜0.01

组别Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax C2 14.84±1.45 18.86±2.06 1.05±0.04 I3 57.17±2.802) 86.37±3.132) 0.46±0.021)I7 77.02±4.112)3) 88.70±4.572) 0.56±0.023)H2 48.05±3.082)3)5) 44.91±3.104)6) 0.98±0.042)6)H+I3 67.72±3.172)3)5) 63.38±3.572)4)6)8) 0.61±0.031)3)7)H+I7 74.04±2.352)3)7) 53.16±3.202)4)6)7)0.73±0.021)3)5)7)

图2 大鼠脑皮质梗死边缘区Bcl-2、Bax的蛋白表达(×400)

3 讨论

脑缺血后缺血部位神经元死亡的形式主要是坏死和凋亡。脑缺血时缺血中心区神经元以坏死为主，而缺血半暗带区则以神经元凋亡为主要形式〔4，5〕。高脂血症从发病机制的特点来看，一方面已经发生了脑组织的相对缺血缺氧及炎症反应，另一方面引起血管损伤并激活血管内皮细胞。这些特征与急性脑缺血的主要病理过程相似。但是，目前还不清楚缺血前脑部是否已经激活了相应的脑保护机制而出现“预处理”(pretreatment)或“预适应”(preconditioning)效果。

脑缺血后，随着病程进展，缺血坏死组织通过组织水解酶及炎症细胞吞噬、消化和吸收，梗死体积缩小，神经功能有所恢复。本实验显示，复合脑缺血模型组与单纯脑缺血组在各时间点对比，神经功能评分没有显著性差异，但缺血后7 d和3 d的差值比较，复合脑缺血模型组差值增大，差异显著，缺血后3 d无显著差异。复合脑缺血模型组与单纯脑缺血组比较，缺血后7 d梗死体积缩小，差异显著。结果表明，复合脑缺血在神经功能恢复及梗死体积改善方面优于单纯脑缺血组。可能与炎症反应在缺血不同时期表达变化有关，也可能与高脂血症病变期诱发体内的某些保护机制有关。

笔者的研究结果显示，Bcl-2、Bax在伴有脑缺血模型各时间点均有高表达，复合脑缺血组和单纯脑缺血组与相应假手术组组内比较，差异显著(P＜0.05);复合脑缺血组与单纯脑缺血组比较，表达下降，缺血后3 d、7 d组间差异显著(P＜0.05)，Bcl-2/Bax比值升高，在缺血后7 d组间差异显著(P＜0.05)。脑缺血后神经细胞凋亡过程中，Bcl-2/Bax比值升高，对神经元有保护作用。复合脑缺血与单纯脑缺血在梗死边缘区神经元凋亡较少，提示高脂血症可能通过炎症因子上调体内抗凋亡基因或下调促凋亡基因的表达，或炎症因子刺激小胶质细胞、巨噬细胞等分泌一些对缺血脑组织损伤修复作用的物质，如MMP-2〔6〕。

炎症细胞因子(IL-6、TNF-α)、趋化因子(MCP-1、IL-8)等可通过基因调控 Bcl-2和 Bax的蛋白，从而影响神经元的存活〔7，8〕。而这些炎症因子也可能在脑缺血缺氧后引起 MMP-2的活化，激活的MMP-2进而导致血脑屏障打开，使炎症因子及炎症细胞透过血脑屏障进入中枢神经脑组织，使潜在的MMP-9激活，加重血脑屏障的渗透性，加速了神经元的死亡。也有研究表明MMPs能够直接诱导细胞死亡，而且认为MMP-9的表达与神经细胞的凋亡同步，参与神经细胞的凋亡过程，但是MMP-2的表达较晚，不直接与神经元的凋亡有关，可能参与了脑缺血后神经细胞的修复〔9〕。笔者的研究表明脑缺血后MMP-2的表达明显增加(P＜0.05)，MMP-2在复合脑缺血7 d组的表达也较为显著(P＜0.05)。也有最新研究，在高脂血症小鼠模型的缺血性微血管中，MMP-2的表达被激活，但是MMP-2激活可能加重了高脂血症引起的血脑屏障的渗透性〔10〕。这提示了高脂血症的基础病理条件能够影响MMP-2的表达，也提示了高脂血症发病机制可能存在脑缺血缺氧现象。MMP-2表达的增加可能参与了复合脑缺血的神经元修复，对脑组织细胞具有保护作用。因此，明确高脂血症的发病机制及MMP-2在高脂血症复合脑缺血的作用机制还需要做深入研究。

高脂血症引起的中风〔11〕，其病机也主要为痰瘀互结，进而导致化毒损络〔12〕。“毒损脑络”的现代生物学依据主要表现为脑缺血后发的生物级连反应，产生的大量自由基和代谢物质，这些物质积聚成为有害的毒性物质〔11，13〕。毒性物质也可以损伤神经胶质细胞和神经元〔14〕。这为中医药防治和治疗高脂血症复合脑缺血/中风提供理论依据。

总之，本研究表明复合脑缺血组与单纯脑缺血组比较，在缺血7 d梗死体积缩小，神经功能及脑组织损伤恢复较快，Bcl-2/Bax比值升高，MMP-2的表达明显增加，可能与高脂血症在痰瘀基础上，激发机体抵抗病邪有关，也有可能是在痰瘀基础上合并脑缺血后一定时间的特殊表现，其远期结果尚需进一步研究。本研究为运用中医治疗中风及中枢神经系统疾病提供了理论基础。

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