低强度脉冲超声对立体培养的人退变髓核细胞的影响

张晓军 胡侦明 郝 杰 沈皆亮 (重庆医科大学附属第一医院骨科，重庆 400016)

椎间盘退变(IDD)是引起椎间盘源性疾病的主要原因。近年来国内外研究发现IDD的本质是椎间盘发生细胞学和生物学的变化，椎间盘细胞的数量和生物活性下降，椎间盘内细胞外基质(ECM)合成的减少和降解的增加〔1，2〕。因此找到某种方法来增加椎间盘细胞的数目和活性，促进细胞外基质的合成，恢复椎间盘的生物活性，是可能修复椎间盘退变的有效手段。低强度脉冲超声(LIPUS)目前作为一种促进骨折愈合的物理治疗方法已经被广泛应用于临床，大量研究证明LIPUS不仅可以促进骨折愈合，而且还对软骨细胞的增殖和细胞外基质分泌具有一定的调节作用〔3〕。椎间盘细胞与关节软骨细胞在基因表达和功能方面具有高度同源性。本研究通过观察低强度脉冲超声对退变椎间盘髓核细胞的作用，以期探索一种能修复椎间盘退变的方法，并能用于临床上治疗因椎间盘退变引起的椎间盘源性疾病。

1 材料与方法

1.1 标本来源 椎间盘髓核组织来源于重庆医科大学附属第一医院脊柱外科住院患者腰后路减压术中切除的髓核，均获得患者知情同意，并通过重庆医科大学附属第一医院伦理委员会批准。退变的椎间盘髓核组织来源于16例病人，年龄60～72岁(男7例，女9例)，所取椎间盘退变程度根据脊柱MRI Pfirrmann分级〔4〕分为GradeⅢ～Ⅵ。

1.2 主要仪器 低强度脉冲超声仪由重庆市超声医学工程重点实验室提供。

1.3 主要试剂 DMEM/F12(1∶1)培养基 (Hyclone，美国)，胎牛血清 (Hyclone，美国)，Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶(Sigma，美国);鼠单抗 COLA2α1抗体(Santa Cruz，美国)，鼠单抗 aggrecan抗体(Santa Cruz，美国);兔抗人Ⅱ型胶原多克隆抗体、S-P试剂盒、DAB显色试剂盒 (博士德，武汉)。RNA抽提试剂盒(Invitrogen，USA)，逆转录试剂盒(TaKaRa，大连)，荧光定量 PCR反应试剂盒(TaKaRa，大连)。

1.4 方法

1.4.1 髓核细胞的分离培养及鉴定

1.4.1.1 髓核细胞的分离培养 术中所取的椎间盘标本，置入预先准备好的内含少量DMEM/F12(Hyclone，美国)培养基的无菌培养皿并置入冰盒内迅速带回实验室。按照文献〔5〕的方法，稍加改进。在超净台内将所取椎间盘组织用眼科剪和眼科镊小心去除软骨终板和纤维环组织，并用PBS缓冲液清洗3遍，去除血污。将髓核组织剪碎至1 mm3大小，置于0.25%的胰酶中，37℃恒温水浴20 min，每5 min摇匀一次，以利于充分消化。加入适量含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，离心(800 r/min，5 min)，弃上清，PBS液冲洗洗、离心2遍，加入0.2%Ⅱ型胶原酶37℃水浴消化3～4 h至组织块基本消失。200目不锈钢细胞筛过滤，离心(800 r/min，5 min)，去除上清液，加入适量PBS液冲洗、离心2遍。用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基吹打混匀细胞，镜下计数，按1.0×105/ml细胞密度种植于25 cm2培养瓶，置37℃、体积分数为5%CO2的培养箱中培养。

1.4.1.2 免疫组化鉴定 取P2代髓核细胞爬片，取出经PBS。液洗后，用4%多聚甲醛固定30 min，3%H2O2室温孵育10 min，蒸馏水洗涤(5 min×3次)。滴加5%BSA封闭液阻断，室温20 min，去除多余液体，加入适当浓度COLA II(1∶200)一抗，4℃冰箱过夜。室温平衡后，PBS洗涤(5 min×3次)，加入生物素标记二抗(1∶400)，37℃ 30 min，PBS液冲洗(5 min×3次)。滴加试剂SABC，室温孵育30 min，PBS液冲洗(5 min×3次)。显色剂DAB显色，蒸馏水洗涤，苏木精复染，脱水、透明、常规封片。阴性对照以一抗稀释液代替一抗。

1.4.2 髓核细胞三维立体培养 参考文献〔6〕并稍加改进，选择P3代细胞转移至6孔板进行三维立体培养。取适量P3代细胞悬液与1.2%的藻酸钠溶液混匀，通过22号针头逐滴加入各孔预先置入100 mmol/L氯化钙溶液的6孔板，形成直径约为2 mm大小的藻酸钙凝珠，静置10 min。吸走剩下的氯化钙溶液，用生理盐水洗涤藻酸钙凝珠3次，再用DMEM/F12培养基洗涤3次。最后每孔加入4 ml含青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml和20%FBS的 DMEM/F12培养液，置 37℃、体积分数为5%CO2的培养箱中培养，每隔2 d换液。

1.4.3 LIPUS作用于三维立体培养髓核细胞 细胞转至6孔板内三维立体 24 h后 开 始 不 同 强 度(0、15、30、60、120 mW/cm2)的超声刺激(20 min/d)，总共1 w。在超声仪的6孔板支架台上涂抹专用超声藕合胶，使6孔板底部紧贴于支架台上的超声探头，开始不同强度的超声刺激。对照组(0 mW/cm2)同条件置于支架台上20 min，不予超声刺激。低强度脉冲超声波频率为1.5 MHz，脉冲频率为1 kHz，超声波作用时间为200 μs，间隙时间为 800 μs。

1.4.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率 选取超声波强度为0、15、30、60、120 mW/cm2分别作用于三维立体培养的髓核细胞1 w后，用浓度为50 mmol/L的柠檬酸钠溶液溶解藻酸钙凝珠，使包埋在其中的髓核细胞游离出来。收集细胞后用PBS洗2次，将细胞重悬结合缓冲液，加入Annexin V-FITC和PI进行标记后用FACS Calibur流式细胞仪(BD公司，美国)检测凋亡率。

1.4.5 RT-PCR检测 根据1.4.4结果，选择超声波强度为30、60、120 mW/cm2作用下的游离髓核细胞。收集细胞提取RNA，检测aggrecan和Ⅱ型胶原的mRNA表达水平。按RNA抽提试剂盒RNAiso Plus说明书提取细胞总RNA，用逆转录试剂盒PrimeScriptR RT reagent Kit With gDNA Eraser将RNA逆转录为cDNA。荧光定量PCR反应使用SYBRR Green Realtime PCR Master Mix试剂。反应体系按说明书执行，iQ5定量PCR仪(Bio-Rad，美国)上机检测。反应条件为:95℃预变性2 min，95℃变性5 s，各自的退火温度30 s，72℃延伸30 s，共35循环。引物序列:COL2 α1 上游:5'-CAGGTGAACCTGGACGAGAG-3'，下游5'-CCCACAGCACCAGTCTCAC-3';聚集蛋白聚糖(aggrecan):上游:5'-GGAATGATGTTCCCTGCAAT-3'，下游:5'-GTCTGCGTTTGTAGGTGGTG-3';GAPDH:上游:5'-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3'，下游:5'-GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3'。以上引物均由生工生物工程公司(上海)合成。结果采用2-ΔΔCt法行相对定量解析。

1.4.6 Western印迹检测 选择1.4.5相同的游离髓核细胞，收集细胞提取总蛋白，检测aggrecan和Ⅱ型胶原的蛋白表达水平。用预冷的PBS液洗涤细胞3次，加入预冷的RIPA裂解液冰上反应30 min，4℃下13 000 g/min离心5 min，收集上清液即为蛋白质粗提物。BCA法测定蛋白质浓度，取等量蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳，电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温下封闭2 h，一抗4℃孵育过夜，TBST液洗涤(15 min×4次);辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，TBST液洗涤(15 min×3次)，ECL显色。常规压片，显影，照相，Quantity One软件分析各条带灰度值。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件，数据以±s表示，数据显著性检验用Dunnett-t检验。

2 结果

2.1 显微镜下细胞形态 细胞5～7 d开始爬壁生长，形态呈短梭形、多角形;9～14 d能爬满培养瓶90%，呈铺路石样或蜂窝状生长，可传第一代(P1);3 w左右能传第二代(P2)。见图1。

图1 细胞镜下观察

2.2 免疫组化鉴定结果 见图2。

图2 免疫组化可见髓核细胞胞质着色呈棕黄色

2.3 流式细胞术检测凋亡 结果显示予以超声强度为30、60、120 mW/cm2的 LIPUS 刺激细胞后，30、60、120 mW/cm2组细胞凋亡率较对照组明显降低，15 mW/cm2与对照组比较无明显差异 (见图3)。

图3 不同超声强度对细胞凋亡率的影响

2.4 RT-PCR检测aggrecan和Ⅱ型胶原mRNA表达水平 结果显示予以超声强度为30、60、120 mW/cm2的LIPUS刺激细胞后，aggrecan和Ⅱ型胶原mRNA表达水平较对照组显著升高，组间比较无明显差异(见图4)。

2.5 Western印迹检测aggrecan和Ⅱ型胶原蛋白表达水平结果显示予以超声强度为30、60、120 mW/cm2的LIPUS刺激细胞后，aggrecan和Ⅱ型胶原蛋白表达水平较对照组(0 mW/cm2)显著升高，组间比较亦无明显差异(见图5)。

图4 Aggrecan和Ⅱ型胶原mRNA水平表达结果

图5 Aggrecan和Ⅱ型胶原蛋白水平表达结果

3 讨论

椎间盘退变涉及髓核、纤维环及软骨终板，但显著的改变还是发生在髓核，如细胞外基质成分合成减少、降解增多，基质水合作用降低，而负责基质合成的髓核细胞的凋亡，在这个病变过程中发挥了关键作用〔7〕。因此，通过抑制髓核细胞的凋亡，促进髓核基质的合成，是可能延缓或修复椎间盘退变的途径。

椎间盘髓核细胞的体外培养技术已非常成熟，既往对体外细胞的相关研究多采用单层培养，而大多细胞体外单层培养一定时间后细胞会发生去分化现象，尤其是髓核细胞，传至3～5代后细胞便开始向纤维细胞分化，增殖能力下降，而藻酸钙凝胶三维立体培养能够很好地保持细胞原有表型〔8〕。本研究对退变椎间盘髓核细胞采用藻酸钙凝珠三维立体培养，更好地模拟体内环境，使髓核细胞保持圆球形，自身所分泌Ⅱ型胶原、蛋白多糖被局限在细胞的周围，使得细胞与细胞外基质之间的密切关系得到了保持，更有利于细胞存活、增殖和合成细胞外基质。因为藻酸钙在交联过程中，凝胶内形成通向表面的放射状管道，增加了藻酸钙凝胶的表面积，提供了细胞需要的营养和代谢产物的交换渠道〔9〕。

超声波主要有三大效应:空泡效应、热效应、机械效应。低强度脉冲超声不用于高强度聚焦超声对组织和细胞的杀死作用，其致热效应很微弱，对细胞主要产生促进增殖和合成相关细胞外基质的生物学效应。低强度脉冲超声在促进骨折愈合方面的确切疗效〔10〕，使得其独特的生物学效应越来越被重视，将其用于软骨等其他软组织方面的研究越来越多〔11，12〕，但其在椎间盘退变方面的研究报道较少。Iwashina等〔13〕发现LIPUS对体外培养的兔正常椎间盘细胞增殖和细胞ECM(主要是蛋白多糖)的合成有促进作用。Kobayashi报道〔14〕LIPUS可以促进人髓核细胞株合成蛋白多糖和 BMP2、FGF7、TGFβR1、VEGF等生长因子及相关受体的表达。

本研究说明一定超声强度的LIPUS有抑制体外三维立体培养的细胞凋亡的作用。LIPUS有促进退变髓核细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白多糖的作用。推测其机制可能为LIPUS通过其机械效应对细胞膜产生一种微应力，使信号传递到细胞内产生一些列生物学效应，亦或通过缝隙连接促进细胞间的信息传递而产生效应〔15〕。但组间比较差异无显著性，提示LIPUS对细胞外基质合成的促进作用在一定范围内无明显剂量依赖性。

1 Loreto C，Musumeci G，Castorina A，et al.Degenerative disc disease of herniated intervertebral discs is associated with extracellular matrix remodeling，vimentin-positive cells and cell death〔J〕.Ann Anat，2011;193(2):156-62.

2 Le Maitre CL，Pockert A，Buttle DJ，et al.Matrix synthesis and degradation in human intervertebral disc degeneration〔J〕.Biochem Soc Trans，2007;35(Pt 4):652-5.

3 Vaughan NM，Grainger J，Bader DL，et al.The potential of pulsed low intensity ultrasound to stimulate chondrocytes matrix synthesis in agarose and monolayer cultures〔J〕.Med Biol Eng Comput，2010;48(12):1215-22.

4 Griffith JF，Wang YX，Antonio GE，et al.Modified Pfirrmann grading system for lumbar intervertebral disc degeneration〔J〕.Spine，2007;32(24):E708-12.

5 Ciapetti G，Granchi D，Devescovi V，et al.Ex vivo observation of human intervertebral disc tissue and cells isolated from degenerated intervertebral discs〔J〕.Eur Spine J，2012;21(1):S10-9.

6 Stephan S，Johnson WE，Roberts S.The influence of nutrient supply and cell density on the growth and survival of intervertebral disc cells in 3D culture〔J〕.Eur Cell Mater，2011;22:97-108.

7 Singh K，Masuda K，Thonar EJ，et al.Age-related changes in the extracellular matrix of nucleus pulposus and anulus fibrosus of human intervertebral disc〔J〕.Spine，2009;34(1):10-6.

8 Darling EM，Athanasiou KA.Rapid phenotypic changes in passaged articular chondrocyte subpopulations〔J〕.J Orthop Res，2005;23(2):425-32.

9 Lin YJ，Yen CN，Hu YC，et al.Chondrocytes culture in three-dimensional porous alginate scaffolds enhanced cell proliferation，matrix synthesis and gene expression〔J〕.J Biomed Mater Res A，2009;88(1):23-33.

10 Pounder NM，Harrison AJ.Low intensity pulsed ultrasound for fracture healing:a review of the clinical evidence and the associated biological mechanism of action〔J〕.Ultrasonics，2008;48:330-8.

11 Naito K，Watari T，Muta T，et al.Low-intensity pulsed ultrasound(LIPUS)increases the articular cartilage type II collagen in a rat osteoarthritis model〔J〕.J Orthopaedic Res，2009;28(3):361-9.

12 Anil K，Richard TC.N.The effects of LIPUS on soft-tissue healing:a review of literature〔J〕.British Medical Bulletin，2009;89:169-82.

13 Iwashina T，Mochida J，Miyazaki T，et al.Lowintensity pulsed ultrasound stimulates cell proliferation and proteoglycan production in rabbit intervertebral disc cells cultured in alginate〔J〕.Biomaterials，2006;27:354-61.

14 Kobayashi Y，Sakail D，Iwashina T，et al.Low intensity pulsed ultrasound stimulates cell proliferation，proteoglycan synthesis and expression of growth factors related genes in human nucleus pulposus cell line〔J〕.Eur Cells Materials，2009;17:15-22.

15 Kotaro S，Siddhesh RA，Arihiko K.Low-intensity pulsed ultrasound and cell-to-cell communication in bone marrow stromal cells〔J〕.Ultrasonics，2011;51:639-44.