复元胶囊治疗气虚血瘀证类风湿关节炎的机制

李学荣 李荣亨 杨敏美 (重庆医科大学附属第一医院中西医结合科，重庆 400016)

类风湿关节炎(RA)属中医学“骨痹”、“尪痹”的范畴，《内经》里有记载:“风寒湿之邪三气杂至，合而为痹，其风气胜者为行痹，寒气胜者为痛痹，湿气胜者为着痹”。历代医家认为RA主要是由于正气不足，腠理不密，卫外不固，感受风、寒、湿之邪气所致，而正气不足、肝肾亏虚是发病基础〔1〕。RA具有起病较缓、病程长、缠绵难愈的特点，从而造成“久病多虚”、“久病多瘀”的病理过程。本研究探讨复元胶囊对气虚血瘀证类风湿关节炎大鼠的治疗作用及其机制，为具有滋补肝肾、益气活血的中药防治气虚血瘀证RA提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雌性SD大鼠60只，体重(200±20)g，由重庆医科大学实验动物中心提供(动物合格证号:SCXK渝20020001)，适应性喂养后1 w后用于实验。

1.2 实验试剂及用药 牛Ⅱ型胶原(CⅡ)、完全弗氏佐剂(CFA)，均购于Sigma公司;冰醋酸、10%水合氯醛，由重庆医科大学附一院实验室提供;TNF-α、IL-1β、IL-6试剂盒，购于上海源叶生物制剂公司。复元胶囊，由黄芪、生晒参、淫羊藿、枸杞子、川芎、丹参、三七等药组成，具有滋肝补肾、益气活血的功效，每粒胶囊重0.41 g，相当于生药2.0 g，重庆希尔安药业有限公司生产。MTX，2.5 mg/片，上海信谊药厂有限公司生产，批号:110804，国药准字:H31020644。

1.3 实验方法

1.3.1 造模方法 将60只大鼠适应性喂养7 d后，随机分空白组12只、造模组48只。参考文献〔2〕方法造模。在无菌条件下，用0.1 mol/L冰醋酸充分溶解牛Ⅱ型胶原蛋白，浓度为4 mg/L，置4℃冰箱过夜后，再与等体积弗氏不完全佐剂(1 mg/ml)混合、震荡至充分乳化，制成CⅡ乳剂，置4℃冰箱保存备用。试验时于每只大鼠尾根部及左足底皮内注射0.25 ml致炎，于14 d后按上述方法和剂量再次免疫。加强注射后，以大鼠四肢足爪均严重肿胀、踝关节直径增长幅度≥2 mm为造模成功，造模过程中有1只老鼠死亡。第二次诱导注射后1 w后，将47只造模组大鼠按照文献〔3〕建立气虚血瘀证模型大鼠。方法是:①游泳:将大鼠置于凉水 (14～16℃)中游泳，疲劳时捞出水面 (疲劳标准以大鼠第一次自然下沉为度)，每日1次。②饥饿和高脂饮食:每只鼠按照大鼠体重40 g/kg标准〔4〕提供高脂饲料 (每5 kg普通饲料加猪油lkg)，每天早上8:00点给予全天量的2/3，晚上8:00给予全天量的1/3。③寒湿:大鼠游泳完后，放置在通风的环境中自然晾干，不给予保温措施和擦拭水迹。连续4 w，即出现精神萎顿、嗜睡、毛发枯黄脱落、轻度稀便、尾尖至根部出现轻度瘀血点等症状，同时随机抽取空白组及模型组大鼠各6只，尾静脉取血，检测血液流变学，模型组较空白组血黏度升高(P＜0.05)，则表明造模成功。

1.3.2 分组及给药方法 造模成功后，将47只大鼠随机分为模型组、复元胶囊组、MTX、联用组，模型组11只，其余每组各12只，各组之间的关节肿胀体积无显著性差异。根据Meeh-Rubner氏公式计算给药剂量，复元胶囊配成汤剂浓度为100 mg/ml，MTX溶液浓度为0.1 mg/ml，药量相当于人体用量的10倍。MTX组和联用组每周1次灌胃给药MTX 2.5 ml/只;复元胶囊组及联用组每日灌胃给复元胶囊汤剂2 ml/只;空白组和模型组每日予同等剂量蒸馏水2 ml/只灌胃，连续给药8 w。

1.4 检测指标

1.4.1 一般状况 观察大鼠的精神状况，毛发，大便，尾部瘀斑轻重，对抗力及攻击力，游泳及耐疲劳时间。

1.4.2 大鼠关节肿胀率 用水容积法，于首次免疫当天检测左足肿胀度，隔日1次，直至处死。以第1天测得关节置换水容积为基值，以后所测值与之相比值而得关节肿胀率。

1.4.3 模型组大鼠血黏度检测 建立气虚血瘀证模型大鼠4 w后，随机抽取空白组及模型组大鼠各6只，尾静脉取血约2 ml，用MVIS-2015全自动血液流变学分析仪测定血液流变学指标，于重庆医科大学附属第一医院中西医结合科完成。

1.4.4 血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平检测 灌胃给药满8 w时，各组大鼠心脏取血约3 ml，分离血清，冻存于-20℃冰箱中待测。采用ELISA法检测大鼠血清TNF-α，放射免疫法测定血清IL-1β、IL-6水平，方法严格按试剂盒说明进行。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件，多组均数间比较采用单因素方差分析和两两比较 (LSD法)。

2 结果

2.1 一般情况 模型组与空白组大鼠比较，精神萎靡、毛发稀疏、反应迟钝、尾部瘀斑及关节红肿明显，联用组与复元胶囊及MTX组比较，大鼠关节肿胀程度轻、毛发有光泽、精神状态好、反应灵敏、尾部瘀斑不明显。

2.2 模型组大鼠血液流变学变化 模型组与空白组比较，血液流变学各项指标均偏高，差异具有统计学意义 (P＜0.05)，模型组大鼠血液流变学变化。见表1。

表1 模型组大鼠血液流变学的变化(± s，n=6)

表1 模型组大鼠血液流变学的变化(± s，n=6)

与空白组相比:1)P＜0.05

组别 全血黏度高切(200/s)全血黏度中切(100/s) 全血黏度低切(3/s) 血浆黏度(mpas) 红细胞聚集指数(Arbc)红细胞电泳时间(s)空白组 5.78±0.23 6.37±0.21 9.88±0.15 1.32±0.12 6.67±0.42 19.89±0.53模型组 6.08±0.481) 8.89±0.171) 13.44±0.121) 1.88±0.111) 8.98±0.291) 28.33±0.281)

2.3 各组大鼠大鼠TNF-α、IL-1β及IL-6的变化 模型组与空白组比较，血清TNF-α、IL-1β及 IL-6含量均升高 (P＜0.05);复元胶囊组、MTX组及联用组与模型组比较，血清TNF-α、IL-1β及IL-6含量均偏低 (P＜0.05);其中联用组与甲氨蝶呤组比较，血清TNF-α、IL-1β及IL-6含量差异显著(P＜0.05)，复元胶囊与MTX组血清TNF-α、IL-1β及IL-6含量差异无统计学意义 (P＞0.05)。各组大鼠TNF-α、IL-1β及IL-6的变化。见表2。

表2 各组大鼠TNF-α、IL-1β及IL-6的变化(pg/ml，±s)

表2 各组大鼠TNF-α、IL-1β及IL-6的变化(pg/ml，±s)

与空白组比较:1)P＜0.05;与模型组相比:2)P＜0.05;与复元胶囊组比较:3)P＜0.05;与MTX组比较:4)P＜0.05

组别 n TNF-α IL-1β 12 10.47±2.61 0.08±0.012 80.23±30.23模型组 11 120.21±2.431) 0.37±0.0141)273.57±32.101)复元胶囊组 12 41.23±2.332) 0.20±0.0172)169.49±33.652)MTX组 12 40.87±2.483) 0.19±0.0323)165.45±34.143)联用组 12 27.57±2.584) 0.12±0.0434)113.87±32.144)IL-6空白组

3 讨论

中医学认为气是有很强活力的精微物质，有推动、温煦、防御、固摄、营养、中介的功能，具有生命物质和生理功能双重属性。《素问.举痛论》说:“百病生于气也”。气为血之帅，气行则血行，气虚则无力鼓动血液运行，尤其是心气不足，更易引起血行不畅，血液初起流动缓慢，继而瘀滞成块，形成虚中夹实的气虚血瘀证。

RA从发病机制及临床特点来看，正气虚弱是发生本病的根本，正气不足，致使机体卫外不固，腠理不密，使风、寒、湿之邪乘虚侵袭，注于经络，留于关节，引发本病。另一方面则是肝肾不足，肝藏血主筋，肾藏精主骨，先天禀赋不足，或各种原因导致肝肾不足，则精血亏虚，筋骨失养，外邪可乘虚入侵，留滞于关节而成本病〔4〕。同时内因(气血亏虚、肝肾不足)和外因(风寒湿等邪)均可致瘀，而瘀血又可作为新的致病因素进一步加重RA病情。初期外邪痹阻经脉，气血运行不畅，进而正邪交争，气滞血瘀，病程迁延日久，进一步损耗正气而致气血亏虚，无力推动血行，而致气虚血瘀。可见，气血亏虚，肝肾不足是本病发生的基础，瘀血阻滞是其基本的病理特征，气虚血瘀贯穿RA的始终。现代医学认为RA患者血浆成分存在异常，如RF、免疫球蛋白IgA、IgM、IgG以及它们的复合物、γ球蛋白或抗原抗体复合物、纤维蛋白原等，由于这些成分的增加，导致了血浆黏度的增加，血浆是血液的重要组成部分，由于血浆成分的增加、血浆黏度的改变、红细胞沉降的加速、血小板数目的增加等，致血液的浓稠性、凝固性、聚集性增加，最终导致全血黏度增高〔5〕。血液流变学指标的变化列为血瘀证的诊断标准之一〔6〕，故在本实验中，建立气虚血瘀证模型大鼠4 w后，检测大鼠血液流变学以评价造模是否成功。由此可见，益气活血化瘀法无论从中医理论还是西医病理，在RA的治疗中均有其使用的理论依据。

甲氨蝶呤是公认的治疗RA首选的缓解病情药物，根据2009年美国风湿病学会治疗RA的推荐意见，一旦诊断明确，应尽早应用甲氨蝶呤，或以此药为基础进行联合治疗〔7〕。此类药物仅能控制RA的症状，且有胃肠道反应、肝功损害、骨髓抑制等不良反应，更佳的疗效在于寻求于中西医结合治疗。复元胶囊由黄芪、生晒参、淫羊藿、枸杞子、川芎、丹参、三七等药组成，具有益气活血、滋肝补肾的功效，肝肾充足则骨有生机，体现标本兼顾的治疗原则。而MTX具有明确的抗炎、抑制免疫反应等作用，能有效缓解RA病情，降低致残率，故选其作为阳性对照。

在RA研究领域中，TNF-a、IL-1β及IL-6在RA发病机制中居于重要地位。TNF-α和IL-1β是RA发病机制中居中心地位的炎症性细胞因子，参与RA的发生、发展过程。TNF-α可以诱导内皮细胞表达黏附分子，促进白细胞与血管内皮黏附渗透导致局部炎症;可刺激滑膜成纤维细胞和软骨细胞产生前列腺素E2和胶原酶等，促进骨质破坏和骨的吸收及成纤维细胞增生，抑制骨胶原的合成，同时可增加滑膜及内皮细胞、成纤维细胞生长因子的释放而促进血管翳的形成〔8〕。IL-1β比TNF-α有更强的刺激基质金属蛋白酶(MMPs)产生及抑制胶原和糖蛋白合成，从而加重骨损伤的作用〔9〕。IL-1β还可刺激滑膜成纤维细胞增殖，增加胶原酶和溶质素分泌，促进滑膜细胞黏附分子(ICAM-1)的表达，使滑膜细胞与浸润性炎性细胞反应性增强〔10〕。在RA中，IL-6不能直接刺激滑膜母细胞和软骨细胞产生作用，而是通过增强TNF-α和IL-1β的效应，并且诱导其他细胞因子的产生发挥致病作用。另外，IL-6还能促进B细胞产生免疫球蛋白IgG、IgM 及合成类风湿因子(RF)〔8〕。

前期实验已证实复元胶囊具有抑制血小板聚集和血栓形成、保护血管内皮细胞(VEC)、调节免疫、抑制炎症反应、调节血液流变学的异常等功能〔11，12〕。本实表明复元胶囊联用甲氨蝶呤能显著降低气虚血瘀证RA大鼠血清炎性介质，其作用机制可能与其具有抗炎镇痛、免疫调节、预防骨质破坏等多重作用有关。本研究证实了对气虚血瘀证RA的治疗，在抗风湿药物治疗同时配伍补益肝肾、益气活血的中成药，能显著减轻炎症过程中的肿胀，改善毛细血管的通透性，降低血清炎性介质水平，药物不良反应无明显增加，值得临床进一步推广应用。

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