带有HPV-16 E6/E7基因的DC疫苗抑制裸鼠宫颈癌生长的机制

符少月 焦庆昉 黄启彬 易发平

(重庆医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室 重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心，重庆400016)

人乳头状瘤病毒(HPV)的持续性感染是导致宫颈癌的最普遍因素〔1，2〕。中国 HPV高危险因素的宫颈癌患者约为14.51%，其中每年的新发病率约为9.6/10万人，死亡率约为4.3/10万人〔3〕。因此研制HPV疫苗对宫颈癌的预防与治疗具有重大意义。树突细胞(DC)被认为是体内功能最强大的抗原提呈细胞，能够激活T淋巴细胞，产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，启动人体的特异性免疫，溶解杀伤肿瘤细胞，因此DC成为研究肿瘤免疫治疗的热点。

1 材料与方法

1.1 材料 宫颈癌细胞CaSki(中国上海生命科学研究院);带有HPV-16 E6/E7基因的重组腺病毒载体、空载体由本课题组成功构建〔4〕;胎牛血清、RPMI1640培养液(美国 Gibco公司);小鼠白细胞介素-4(rmIL-4)、重组小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)(美国Peprotech公司);鼠抗E7多克隆抗体(Santa Cruz公司);HRP标记的山羊抗小鼠IgG、ECL发光试剂和CCK8试剂盒(碧云天生物技术研究所);小鼠淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品公司);鼠抗CD4单克隆抗体(Abcam公司)，免疫组化试剂盒(北京中杉公司)。C57BL/6小鼠，4～5周龄，雄性(重庆医科大学实验动物中心);BALB/c小鼠，6～8周龄，雌性(重庆医科大学实验动物中心)，饲养于SPF房间。裸小鼠，4～5周龄，雌性(重庆医科大学实验动物中心)，饲养于IVC房间。证书编号:CQLA-2011-0047。

1.2 HPV-l6 E6/E7树突细胞疫苗的制备 处死C57BL/6小鼠，无菌操作取出股骨和胫骨，剔除肌肉组织，用无菌1 ml注射器吸取PBS冲洗骨髓腔，获得骨髓。1 000 r/min离心10 min，收集细胞，加入4 ml红细胞裂解液吹散并静置5 min，然后1 000 r/min离心10 min。用RPMI1640洗涤2遍，收集细胞并加入RPMI1640完全培养基，调整细胞密度为3×109个/ml接种于6孔板，加入细胞因子rmGM-CSF和rmIL-4并调整其浓度为10 ng/ml。培养48 h后半量换液，并补足相同浓度的细胞因子。每天在显微镜下观察细胞形态。收集培养至第6天的未成熟树突细胞(imDCs)，分别加入感染复数为200的腺病毒pAd-E6/E7和空载体pAd-mock。于6孔板中培养2 h后，再加入含细胞因子rmGM-CSF和rmIL-4的细胞培养液，调整细胞因子浓度为5 ng/ml。继续培养36 h，分别提取pAd-E6/E7感染的DC、pAd-mock感染的DC及未成熟DC的总蛋白。按每孔蛋白上样量为30 μg进行12%的SDS-PAGE，转膜，采用含5%脱脂奶粉室温封闭1 h，1∶200稀释的鼠抗E7多克隆抗体于4℃孵育过夜，TBST洗膜5次，每次5 min，1∶1 000 HRP标记的IgG室温孵育1 h，ECL显色，检测目的蛋白E7的表达。

1.3 DC疫苗对裸鼠体内宫颈癌的抑制作用 将BALB/c小鼠随机分为3组，每组4只，分别为pAd-E6/E7-DC组(树突细胞疫苗组)、pAd-mock-DC组(树突细胞空载体组)、DC组(树突细胞组)。背部左侧皮下注射，每只200 μl、细胞密度为1×107个/ml的pAd-E6/E7-DC、pAd-mock-DC和DC，空白对照组注射200 μl PBS。每7 d免疫1次，共3次。第21天处死各组小鼠，无菌条件下取出脾脏，制成单细胞悬液。1 500 r/min离心10 min收集细胞，加入4 ml小鼠淋巴细胞分离液吹散，再于液面上轻轻加入500 μl RPMI1640培养液，2 000 r/min垂直离心30 min，轻轻吸出第二层乳白色细胞层。用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液洗涤两次获得CTL。与分组相对应简称为pAd-E6/E7-DC-CTL、pAd-mock-DC-CTL、DC-CTL。将 16 只裸鼠随机分成4组，分别为pAd-E6/E7-DC-CTL-CaSki组、pAd-mock-DC-CTL-CaSki组、DC-CTL-CaSki组和 CaSki组(空白对照)。先于每组小鼠背部左侧皮下注射200 μl细胞密度为1×107个/ml的CaSki细胞，3 d后各组分别腹腔注射500 μl细胞密度为1×107个/ml的 pAd-E6/E7-DC-CTL、pAd-mock-DC-CTL和DC-CTL，CaSki组注射500 μl PBS。每天观察裸小鼠的生长状况，肿瘤长出后每7 d测量肿瘤的最长径(a)和最短径(b)，绘制肿瘤生长曲线。

1.4 CCK8法检测免疫BALB/c小鼠体内T淋巴细胞的增殖将BALB/c小鼠随机分为4组，每组4只，分别为pAd-E6/E7-DC组(树突细胞疫苗组)、pAd-mock-DC组(树突细胞空载体组)、DC组(树突细胞组)、PBS组(空白对照组)。背部左侧皮下注射，每只200 μl、细胞密度为1×107个/ml的 pAd-E6/E7-DC、pAd-mock-DC 和 DC，空白对照组注射 200 μl PBS。每7 d免疫1次，共3次。第21天处死各组小鼠，无菌条件下取出脾脏，按1.3法离心收集淋巴细胞，加入2 ml培养液重悬。取100 μl细胞液接种于96孔板中，以完全培养液作为对照，每组设3个重复。细胞培养24 h后，按CCK 8检测试剂盒方法测定细胞增殖效应，酶联免疫检测仪测定各孔吸光值(OD)，波长为450 nm。各组OD值 =各实验组 OD值-空白对照组OD值。计算平均值为最终OD值。

1.5 免疫组化法检测裸鼠脾脏组织CD4+T淋巴细胞的表达处死肿瘤生长第28天裸鼠，分离脾脏组织，固定于4%多聚甲醛，石蜡包埋、切片，二甲苯脱蜡，抗原修复，血清封闭30 min，滴加一抗(CD4+，1∶50)4℃过夜，加生物素化二抗，滴加HRP标记的亲和素37℃ 30 min，DAB显色，苏木精染色，碳酸锂返蓝约10 s，烘干，树脂封片，检测CD4+T淋巴细胞表达。

1.6 统计学方法 采用SPSS18软件进行统计分析，实验数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 HPV-16 E6/E7树突细胞疫苗的制备 细胞培养至第5天，显微镜下观察发现细胞密且多，很多悬浮成簇、呈集落状生长，即为未成熟的树突细胞，见图1箭头所示。于第6天收集未成熟的DC，加入重组腺病毒载体(pAd-E6/E7)和空载体(pAd-mock)进行转染，培养36 h，Western印迹检测，发现pAd-E6/E7-DC组有一条目的蛋白E7的表达，两个对照组pAdmock-DC组和DC组中无表达，见图2。

图1 培养第5天小鼠未成熟DC形态(×100)

图2 Western印迹检测各组E7蛋白的表达

2.2 CCK8法检测免疫BALB/c小鼠体内T淋巴细胞的增殖pAd-E6/E7-DC组小鼠的OD值(0.681 3±0.051 5)高于对照组pAd-mock-DC组(0.590 4±0.035 0)DC组(0.584 9±0.053 2)和 PBS组(0.462 4±0.081 5)(P＜0.05、P＜0.01)。

2.3 免疫组化法检测裸鼠脾脏组织CD4+T淋巴细胞的表达pAd-E6E7-DC-CTL-CaSki组 CD4+表达量最高，pAd-mock-DC-CTL-CaSki组和DC-CTL-CaSki组CD4+表达量次之，CaSki组CD4+表达量最低。见图3。

2.4 裸鼠的肿瘤体积分析 随着时间的延长CaSki组肿瘤体积不断变大，pAd-E6E7-DC-CTL-CaSki组、pAd-mock-DC-CTLCaSki组和DC-CTL-CaSki组的肿瘤体积不断减小，pAd-E6E7-DC-CTL-CaSki组的肿瘤体积减小幅度最大。见图4。

图3 各组裸鼠脾脏CD4+T淋巴细胞的表达

图4 各组小鼠肿瘤体积变化曲线

3 讨论

HPV 16的持续感染引起宫颈癌、阴道癌、外阴癌、肛门癌、口咽癌等，而在这些肿瘤当中，最引人瞩目的是表达特异性E6和E7蛋白的宫颈癌〔5〕。宫颈癌的致病机制被认为与E6、E7蛋白的早期表达密切相关〔6〕。E6蛋白可以诱导端粒酶活性，进而维持端粒长度而使上皮细胞出现永生化。而E7蛋白通过CR1与Rb蛋白的相关因子-p600作用，促进细胞的独立生长及转化，进而引起上皮细胞出现转化、永生化〔7〕。因此，基于E6、E7基因的肿瘤生物治疗已经成为研究热点。

目前已经有两个预防性HPV疫苗获得美国食品药品监督管理局承认，但是预防性疫苗对已经存在的HPV感染和HPV相关的病变没有治疗作用〔8〕，而且由于全球HPV感染范围之大，预防性疫苗需要花几十年的时间才能对流行的宫颈癌起到作用。为了加快控制宫颈癌患者增长的速度，研制HPV治疗性疫苗至关重要〔9〕。DC是有效的抗原提呈细胞，能够激活初始型T淋巴细胞，在机体感染或接种疫苗时是诱导机体免疫反应的重要因素〔10，11〕。DC疫苗在抗肿瘤免疫应答中显示出巨大的潜能〔12〕。近年来，DC疫苗的临床试验也已经应用到前列腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、肾细胞瘤等的治疗，并取得一定效果〔13〕。但基于不同肿瘤的DC疫苗研制，尚需进一步探讨。

本研究表明HPVl6E6E7基因修饰的DC疫苗能够抑制肿瘤生长。DC疫苗促进了DC疫苗免疫的BALB/c小鼠体内T淋巴细胞的增殖。DC疫苗能够捕捉肿瘤抗原，溶解处理后与组织相容性复合物(MHC)-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子结合形成MHC分子-抗原肽复合物，表达于细胞表面，提呈给T细胞，在此过程中DC细胞逐渐成熟，许多黏附分子、共刺激分子表达上调，为T细胞提供第二活化信号，促进T细胞增殖、分化、产生CTL，杀伤肿瘤细胞〔14〕。

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3 Wang SM，Shi JF，Kang DJ，et al.Impact of human papillomavirus-related lesions on quality of life:a multicenter hospital-based study of women in Mainland China〔J〕.Int J Gynecol Cancer，2011;21(1):182-8.

4 焦庆昉，潘巍巍，易发平，等.人乳头状瘤病毒16亚型 E6E7基因重组腺病毒的构建及其在小鼠骨髓源树突细胞中的表达〔J〕.中国生物制品学杂志，2011;24(1):25-9.

5 Trimble CL，Frazer IH.Development of therapeutic HPV vaccines〔J〕.Lancet Oncol，2009;10(10):975-80.

6 Moscicki AB.HPV vaccines:Today and in the future〔J〕.Adolesc Health，2008;43(4):26-40.

7 Yugawa T，Kiyono T.Molecular mechanisms of cervical carcinogenesis by high-risk human papillomaviruses:novel functions of E6 and E7 oncoproteins〔J〕.Med Virol，2009;19(2):97-113.

8 Lin K，Doolan K，Hung CF，et al.Perspectives for preventive and therapeutic HPV vaccines〔J〕.Formos Med Assoc，2010;109(1):4-24.

9 Hung CF，Ma B，Monie A，et al.Therapeutic human papillomavirus vaccines:current clinical trials and future directions〔J〕.Expert Opin Biol T-her，2008;8(4):421-39.

10 Cubillos-Zapata C，Guzman E，Turner A，et al.Differential effects of viral vectors on migratory afferent lymph dendritic cells in vitro predict enhanced immunogenicity in vivo〔J〕.J Virol，2011;85(18):9385-94.

11 Ballestrero A，Boy D，Moran E，et al.Immunotherapy with dendritic cells for cancer〔J〕.Adv Drug Deliv Rev，2008;60(2):173-83.

12 Lebson L，Wang T，Jiang Q，et al.Induction of the glucocorticoid induced leucine zipper gene limits the efficacy of dendritic cell vaccines〔J〕.Cancer Gene Ther，2011;18(8):563-70.

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14 Palucka K，Banchereau J.Cancer immunotherapy via dendritic cells〔J〕.Nature Rev Cancer，2012;12(4):265-77.