曲古抑菌素A抑制乳腺癌细胞MCF-7生长增殖及促进凋亡的机制

张秀梅 刘 超 刘 阳 肖建英 (辽宁医学院生物化学教研室，辽宁 锦州 121000)

曲古抑菌素A(TSA)是一种氧肟酸类非竞争性可逆的组蛋白去乙酰基酶(HDAC)抑制剂，也是四类HDAC抑制剂的代表药物之一。近年研究表明，TSA可以纳摩尔的浓度特异抑制哺乳动物组蛋白去乙酰基酶，使高度酰基化的组蛋白积累，激活基因表达、从而抑制多种肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞分化或凋亡，并且有细胞周期阻滞的作用〔1〕。值得注意的是，TSA的这些作用只针对肿瘤细胞，而对正常细胞无毒副作用，因此其抗肿瘤作用具有很好的选择性。目前，TSA作为一种高效、低毒的组蛋白去乙酰化酶抑制剂备受关注。目前研究表明，TSA能够诱导很多培养的转化细胞生长停滞、分化，包括白血病细胞、肝癌、肺癌、结肠癌的细胞等〔2～4〕;本实验采用人乳腺癌MCF-7细胞，通过观察TSA对MCF-7细胞生长增殖、凋亡的影响及抑癌基因p21、p53表达水平，探讨TSA抑制肿瘤细胞增殖及促进凋亡的机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 TSA、DMEM培养液、RT-PCR试剂盒(大连宝生物)、Trizol试剂(GIBCOBRL)兔抗人p21，p53多克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶耦联的IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司，PCR扩增仪(德国Eppendorf公司)，Sunrise自动酶标检测仪(瑞士TECAN公司)。

1.2 细胞培养与观察 乳腺癌细胞株MCF-7购自上海生命科学院细胞和生物化学研究所。培养于DMEM培养液中，饱和湿度、37℃、5%CO2的条件下进行传代培养。当处于对数生长期时以105个/ml浓度接种于25 cm2的培养瓶，24 h后待细胞贴壁后给药，使 TSA 终浓度分别为 50、100、200、400 nmol/L，对照组加入5 μl DMSO〔DMSO浓度小于0.1%(V/V)，此浓度对细胞生长无影响〕。

1.3 MTT法分析TSA对细胞增殖的影响 将96孔板每6孔设为一组，共设5组，第1组为对照组(培养液中含5 μl DMSO)。2～5组加入终浓度分别为 50、100、200、400 nmol/L 的TSA。将消化好的MCF-7细胞悬液，以5×103个/孔接种于96孔培养板中，每孔200 μl，将于孵箱中培养24 h的细胞培养液吸出，按照上述分组分别施加处理因素，放入CO2孵箱中培养。培养 48 h后取出培养板，加入新鲜培养液及50 μl MTT(1 mg/ml)孵育 4 h后，弃去培养液，然后加入 DMSO(100 μl/孔)，振荡15 min，使沉淀物充分溶解。用自动酶标分析仪于490 nm波长下检测光密度值。根据光密度值的大小来判断活细胞数，存活率=加药组A值/对照组A值×100%。

1.4 流式细胞仪检测细胞的凋亡率 MCF-7细胞株接种于25 cm2的培养瓶中，培养24 h待细胞贴壁后给药，TSA终浓度分别为 50、100、200、400 nmol/L，对照组加入 5 μl DMSO。继续培养48 h后，取出培养瓶，去除培养液，加入2 ml胰酶-EDTA消化液消化1 min左右，加入5 ml培养液，用吸管反复吹打成单细胞悬液，计数后收集细胞于离心管中，1 000 r/min离心5 min，最后将细胞收集于试管中，使每个管中的细胞为106个左右。参照试剂盒说明，将细胞重悬于200 μl中，加入10 μl AnnexinV-FITC和 5 μl PI，轻轻混匀，避光室温反应15 min，加入300 μl结合缓冲液后上机检测。

1.5 半定量RT-PCR检测p21，p53基因mRNA的表达 采用Trizol一步法提取细胞总RNA。使用AMV逆转录酶合成cDNA第一链，在Taq酶的作用下进行PCR的扩增。p21的循环条件:94℃ 2 min、94℃ 变性 30 s、60℃ 30 s、72℃ 1 min、30 个循环、72℃ 5 min;p53的循环条件:94℃ 2 min、94℃ 变性 30 s、58℃ 30 s、72℃ 1 min、30 个循环、72℃ 5 min;β-actin 的循环条件:94℃ 2 min、94℃ 变性 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min、30 个循环、72℃ 5 min。PCR产物10 μl进行琼脂糖凝胶电泳并拍照，应用凝胶图像分析管理系统进行灰度测量，mRNA的表达水平以每一样品与其内参β-actin灰度比值表示。PCR引物序列及扩增片段长度如下:p21上游引物:5'-AGCAGAGGAAGACCATGTGG-3';下游引物:5'-GGGTATGTACATGAGGAGGT-3'扩增片段长度:318 bp;p53上游引物:5'-CAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTAC-3';下游引物:5'-CTATGTCAAAAAGTGTTTCTGTCATC-3';扩增片段长度:292 bp。β-actin上游引物:5'-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3';下游引物:5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3';扩增片段长度661 bp。

1.6 Western印迹法检测p21，p53蛋白的表达 用蛋白裂解液提取对数生长期细胞总蛋白，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测蛋白浓度，-20℃或-80℃保存备用。电泳前，加入SDS样品缓冲液，100℃煮沸5 min，离心后上样，10%SDS-PAGE电泳分离，然后将蛋白转至硝酸纤维素膜上，之后用含5%BSA的TBST(pH7.4)将滤膜于室温摇动温育2 h进行封闭，封闭后的滤膜再分别与p21，p53抗体(稀释比为1∶200)4℃温育过夜。经TBST洗涤后，辣根过氧化物酶耦联的IgG作为二抗(稀释比为1∶5 000)室温温育2 h，洗膜后，使用ECL发光法显色内参采用β-actin。扫描X光片，计算机软件处理，进行密度分析，计算灰度值。

1.7 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件进行分析，数据以±s表示，多样本均数检验采用方差分析的方法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞存活率检测结果 MCF-7细胞经不同浓TSA作用后，各组细胞存活率随着药物浓度的升高而降低(P＜0.01)，且呈剂量依赖性。见表1。

2.2 细胞凋亡率检测结果 MCF-7细胞株经TSA作用后，各浓度组细胞凋亡图及凋亡率见表1和图1，各浓度组凋亡率随着TSA浓度的升高而升高(P＜0.01)。

2.3 TSA对MCF-7细胞p21、p53基因mRNA的表达的影响与对照组相比，TSA组在一定浓度范围内(50～400 nmol/L)随着药物浓度的增加，p21 mRNA表达水平逐渐增加并成剂量依赖性;而p53的表达未见明显变化。见表2、图2。

表1 TSA对MCF-7细胞存活率和凋亡率的影响(± s，n=6，%)

表1 TSA对MCF-7细胞存活率和凋亡率的影响(± s，n=6，%)

与对照组比较:1)P＜0.01;与前一组比较:2)P＜0.01;下表同

TSA浓度(nmol/L)存活率 凋亡率0(对照组)0.931 6±0.17 2.81±0.15 50 0.808 4±0.341) 3.02±0.221)100 0.704 3±0.251)2) 12.74±0.902)200 0.614 2±0.111)2) 20.32±0.762)400 0.501 8±0.211)2) 44.32±0.582)

图1 Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞散点图

表2 TSA对p21、p53mRNA的表达水平的影响(± s，n=3)

表2 TSA对p21、p53mRNA的表达水平的影响(± s，n=3)

TSA 浓度(nmol/L) p53/β-actin p21/β-actin 0(对照组)0.121±0.078 0.053±0.056 50 0.135±0.057 0.154±0.0261)100 0.148±0.065 0.297±0.0332)200 0.135±0.047 0.404±0.0422)400 0.143±0.076 0.412±0.0531)

表3 TSA对p21、p53蛋白的表达水平的影响(± s，n=3)

表3 TSA对p21、p53蛋白的表达水平的影响(± s，n=3)

TSA 浓度(nmol/L) p53/β-actin p21/β-actin 0(对照组)0.156±0.023 0.126±0.035 50 0.173±0.051 0.254±0.0471)2)100 0.145±0.034 0.376±0.0391)2)200 0.165±0.047 0.575±0.0531)2)400 0.138±0.054 0.725±0.0691)2)

2.4 TSA对MCF-7细胞p53、p21蛋白表达的影响 与对照组相比，TSA组在一定浓度范围内(50～400 nmol/L)随着药物浓度的增加，p21的蛋白表达逐渐增加，呈剂量依赖性，而p53的蛋白表达未见明显变化，见表3、图3。

3 讨论

图2 TSA对p21、p53 mRNA表达的影响

肿瘤的发生和发展与细胞增殖的失控、分化障碍及凋亡受阻密切相关，细胞增殖是通过细胞周期来实现的，阻滞细胞周期即能起到阻止细胞增殖的作用;细胞凋亡的受阻增加了细胞突变的概率，进而诱发肿瘤的发生。

p53是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的基因，野生型的p53在维持细胞正常生长，抑制恶性增殖中起着重要作用，p53时刻监控着细胞染色体DNA的完整性，一旦细胞染色体DNA遭到损害，p53蛋白与基因的DNA相应部位结合，起特殊转录因子的作用，活化p21基因的转录，使细胞停滞于G1期，参与DNA的复制与修复。如果修复失败，p53蛋白即启动凋亡过程诱导细胞自杀，阻止有癌变倾向突变细胞的生成，从而阻止细胞恶变〔5〕。

本研究与文献报道相一致〔6〕。本实验提示，TSA抑制细胞增殖可能与其维持p53的稳定表达有关，p53蛋白很不稳定，在细胞中极易被降解，曾有文献报道〔7〕TSA能够稳定p53的乙酰化水平，使p53不被蛋白酶体降解，从而促进其下游因子p21基因的转录，进而提高p21的表达，支持本实验结果。p21位于p53的下游，是细胞周期的重要的抑制因子，p21可与细胞周期依赖性蛋白激酶结合，从而阻止细胞进入S期，抑制细胞增殖。TSA促进凋亡的机制也可能与其稳定p53的表达有关。曾有文献报道〔8〕，TSA能够促进C6胶质瘤细胞的凋亡。Boulaiz等〔9〕也曾报道在MCF-7细胞中gef基因的表达诱导凋亡是通过p53途径实现的。

综上，TSA抑制MCF-7细胞增殖、促进凋亡的机制可能是通过稳定p53的表达，从而促进p21基因的表达，进而抑制细胞周期依赖性蛋白激酶的活性，从而抑制细胞增殖，关于TSA促进MCF-7细胞凋亡的机制正在进一步研究之中。

图3 Western印迹法检测细胞周期相关蛋白表达

1 Pan LN，Lu J，Huang B.HDAC inhibitors:a potential new category of anti-tumor agents〔J〕.Cell Mol Immunol，2007;4(5):337-43.

2 Fortson WS，Kayarthodi S，Fujimura Y，et al.Histone deacetylase inhibitors，valproic acid and trichostatin-A induce apoptosis and affect acetylation status of p53 in ERG-positive prostate cancer cells〔J〕.Int J Oncol，2011;39(1):111-9.

3 Xiong H，Du W，Zhang YJ，et al.Trichostatin A，a histone deacetylase inhibitor，suppresses JAK2/STAT3 signaling via inducing the promoter-associated histone acetylation of SOCS1 and SOCS3 in human colorectal cancer cells〔J〕.Mol Carcinog，2012;51(2):174-84.

4 Puppin C，Passon N，Franzoni A，et al.Histone deacetylase inhibitors control the transcription and alternative splicing of prohibitin in thyroid tumor cells〔J〕.Oncol Rep，2011;25(2):393-7.

5 查锡良.生物化学〔M〕.北京:人民卫生出版社，2008:476.

6 王 新，肖建英，张秀梅，等.TSA对甲状腺鳞癌SW579细胞株生长增殖的影响〔J〕.辽宁医学院学报，2008;29(1):17-9.

7 Roy S，Packman K，Jeffrey R，et al.Histone deacetylase inhibitors differentially stabilize acetylated p53 and induce cell cycle arrest or apoptosis in prostate cancer cells〔J〕.Cell Death Different，2005;12:482-91.

8 Hsu YF，Sheu JR，Hsiao G，et al.p53 in trichostatin A induced C6 glioma cell death〔J〕.Biochim Biophys Acta，2011;1810(5):504-13.

9 Boulaiz H，Alvarez PJ，Prados J，et al.Gef gene expression in MCF-7 breast cancer cells is associated with a better prognosis and induction of apoptosis by p53-mediated signaling pathway〔J〕.Int J Mol Sci，2011;12(11):7445-58.