天麻通脑颗粒对急性脑梗死大鼠血管神经再生的影响及作用机制

王国媛 吴明华 韩 漾 梁 森 马 立 吴颢昕 (南京中医药大学，江苏 南京 20009)

脑梗死属于缺血性脑血管疾病，约占全部脑血管意外的60% ～80%〔1〕，具有发病率高、致残率高、死亡率高、易复发、预后差等特点。我国脑卒中年发病率为(109.7～217)/10万，死亡率为(116～141.8)/10万，居于城市致死疾病之首位〔2〕;幸存者中也有近四分之三患者留有严重后遗症，给社会和家庭带来沉重的负担。天麻通脑颗粒(组方:天麻、钩藤、石斛、川芎、赤芍、制南星、天竺黄、僵蚕、地龙、水蛭)，以经典方剂天麻钩藤饮和通窍活血汤化裁加减而成;具有平肝息风与活血化痰共治作用，使痰化而血行、血行则痰清，气血流畅，以达治疗之效〔3〕。本次研究旨在观察天麻通脑颗粒对缺血性脑卒中大鼠行为学和脑组织形态学的变化，探讨其对大脑中动脉梗死大鼠的缺血性脑卒中后神经血管再生的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂 天麻通脑颗粒(江苏省中医院提供)，5-溴脱氧尿核苷(BrdU，Sigma公司，美国)，过氧化物酶结合的抗生物素蛋白链菌素(1∶500，Jackson公司，美国)，小鼠单克隆BrdU一抗(1∶800，Sigma公司，美国)，生物素化的羊抗鼠 BrdU二抗(1∶500，Jackson 公司，美国)，显色剂 DAB(Sigma 公司，美国)，光学显微镜(Olympus BX51，日本)。

1.2 动物模型的制作与分组 健康成年雄性SD大鼠54只，体重280～330 g(南京中医药大学实验动物中心提供)。随机分为假手术组(n=18)和模型组(n=36)。参照《现代神经科学研究方法》〔4〕中所记载的线栓法制作大鼠大脑中动脉局灶性缺血再灌注(MCAO)模型和Zea Longa等〔5～7〕的方法。模型组以10%水合氯醛(350 mg/kg，ip)麻醉大鼠，不宜一次性进行深度麻醉，先给予标准用量之最小量，术中如有清醒迹象以≤0.1 ml的用量逐次增加，术后可较快清醒并出现自主运动。大鼠仰卧位固定，取颈部正中切开皮肤，钝性分离皮下组织、右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉及各动脉分支。手术过程中注意避免刺激气管和神经，减少手术出血。颈外动脉下远端穿线，结扎后将动脉在两线间剪断。用无损伤动脉夹夹闭颈总动脉和颈内动脉。将一头端烧成梭状的钓鱼线(直径约0.23～0.26 mm)插入颈外动脉，穿过其与颈内动脉的相交处进入颈内动脉。去除颈内动脉夹的同时继续将线插入到颅内段，插线长度自颈内动脉起始部算起约为16～18 mm。除去动脉夹，缝合颈部伤口，插线的末端固定于切口外。大约90 min～2 h后将线轻轻抽出进行再灌注。术后实验大鼠完全清醒并开始自主运动时，以出现追尾反应，即向偏瘫侧转圈运动;或大鼠提尾状态下，缺血对侧出现前肢向内屈收为阳性反应，证明造模成功。假手术组不做颈内动脉置线，其余步骤基本相同。将MCAO模型组大鼠于术后随机分为模型对照组和给药组每组18只，经24 h后分别通过灌胃给药法给予等量等渗生理盐水或天麻通脑颗粒，4 ml/次，2次/d;假手术组灌胃给药法给予等量等渗生理盐水4 ml/次，2次/d，共14 d。于开始给药后第10、11、12天腹腔注射溶于等渗盐水中配制成1%的BrdU溶液，50 mg/kg，1 次/8 h，2 次/d。

1.3 主要检测指标

1.3.1 神经功能测定 参照《现代神经科学研究方法》〔4〕采用神经功能缺损评分标准(NSS)，每组随机抽取6只，均设4个时间点，于术后2 h、1 d、7 d、14 d进行评价。无任何异常行为，0分;提起鼠尾，健侧前肢内旋、肩内收为损伤较轻，1分;上述症状基础上，置于光滑平面，向健侧推挡时阻力减弱或动物转圈追尾爬行，为中度损伤，2分;提起鼠尾，向患侧旋转，损伤较严重，3分;动物处于精神抑制状态，不能进行自发活动，4分。

1.3.2 梗死灶体积的测定 MCAO后经连续给药14 d，每只大鼠以4%多聚甲醛进行心脏灌注，后断头取脑，4%多聚甲醛中固定约24 h后，冰冻切片机上切取大脑中动脉周围脑组织冠状切片，片厚16～20 μm，各取5～7片，间隔约2 mm，采用苏木素伊红染色法，评价梗死灶体积〔8〕。梗死体积用其占未缺血侧半球的百分数表示。

1.3.3 BrdU免疫组化检测 MCAO术后给药14 d，大鼠深度麻醉后，先以250 ml生理盐水快速冲洗左心室，再用4%多聚甲醛心脏灌注后立刻断头取脑;脑组织置于固定液中保存，每次使用前于30%蔗糖溶液中脱水过夜。冰冻切片机上进行连续冰冻切片(片厚10～13 μm);将切片置于50%甲酰胺2×SSC缓冲液(pH7.0)中60℃温水浴2 h，再置于2 mol/L盐酸溶液中37℃温水浴30 min，促使其DNA变性;3%H2O2反应约5～10 min以消除内源性过氧化物酶的活性;5% ～10%牛血清白蛋白(PBS稀释后)室温下封闭30 min;去血清后不洗，直接加入稀释后一抗(约50 μl)，温箱37℃ 1～2 h或4℃过夜;PBS漂洗后加二抗室温孵育2 h;DAB显色5～10 min左右，镜下控制并即时终止显色;水洗3 min后，复染，常规树脂封片;阳性产物为棕黄色或棕褐色〔9〕;200倍光镜下对每张切片缺血侧室管膜下区(SVZ)及纹状体进行BrdU阳性细胞计数。

1.4 统计学分析 应用SPSS18.0软件行t检验。

2 结果

2.1 神经功能缺损评分 模型对照组大鼠于术后2 h和第1天神经功能损伤情况严重，之后有自发恢复的趋势。给药组大鼠的神经功能与模型对照组比较已有显著恢复，并随时间推移其治疗效果越明显。术后2 h、1 d、7 d、14 d，模型对照组评分分别为2.6±0.5、2.7±0.5、1.8±0.4、1.7±0.5;给药组分别为2.6±0.5、2.5±0.5、1.5±0.6、0.8±0.4(P 值分别为1.000、0.448、0.043、0.031)。由此可见天麻通脑颗粒的干预显示出的正性作用。假手术组大鼠无神经功能缺损症状。

2.2 梗死灶体积测定 术后14 d，模型对照组以大片状居多，缺血梗死严重，随切片深入有加重趋势;给药组以分散状为主，缺血梗死较轻，随切片深入有分散均匀且逐渐减轻的趋势。模型对照组与给药组梗死灶体积差异有统计学意义(P=0.044)。假手术组大鼠无梗死灶。模型对照组缺血梗死严重且大片状居多，随切片深入有加重趋势;给药组则缺血梗死较轻多以分散状为主，随切片深入有减轻的趋势。见表1和图1。

2.3 BrdU阳性细胞 假手术组中只限于SVZ区出现少量BrdU阳性细胞，纹状体区并未见阳性细胞。模型对照组阳性细胞数量较少、分布零散;而给药组经术后14 d给药后，SVZ及纹状体的阳性细胞数量较模型对照组有显著增加(P＜0.05)，且细胞核深染、排列紧凑。见表1和图2。

图1 模型对照组与给药组不同视角梗死灶体积表达(苏木素伊红染色，×400)

表1 各组大鼠脑梗死后14 d梗死灶体积及BrdU阳性细胞数(n=6，±s)

表1 各组大鼠脑梗死后14 d梗死灶体积及BrdU阳性细胞数(n=6，±s)

1)给药组与模型对照组比较

组别 梗死灶体积(%)BrdU阳性细胞数SVZ 0±0 37.3±16.7 0±0模型对照组 46.8±12.8 196.3±35.8 222.3±35.3给药组 19.5±9.1 317.9±53.8 330.8±55.1 P值1)缺血侧纹状体假手术组0.044 0.009 0.040

图2 模型对照组与给药组不同脑区BrdU阳性细胞表达(免疫组化染色)

3 讨论

脑梗死属于中医学“中风”范畴，中医学将其归于“中风”、“偏枯”、“类中”、“卒中”等范畴，多因脏腑功能失调，元气耗伤，忧思恼怒等使瘀血阻滞，痰热内蕴，阳化风动，血随气逆而上犯于脑，终致脑脉瘀滞所致〔10〕。本研究所讨论的是缺血性脑卒中，其病因病机复杂多变，临床上亦无法单以一种观点把握疾病整体的变化转归。《中风病辨证诊断标准》〔11〕确立的病理因素有风、火、痰、瘀、气虚、阴虚阳亢六种，瘀血与痰浊是缺血性脑卒中的主要致病因素和病理产物。《素问·调经论》曰“孙络水溢，则经有留血”。《医方考》曰:“中风，手足不用，日久不愈者，经络中有湿痰死血也。”唐容川《血证论》曰:“痰水日久，亦能化为瘀血”，“须知痰水之壅皆为瘀血使然，但去瘀血则痰水自消”。在脑卒中急性期风、火、痰邪为主要病因，随着疾病的发展风渐停、火渐熄，终成痰瘀阻络为患，二者既可单独出现于疾病过程中，又经常相兼致病、贯穿始终，是缺血性中风急性期的重要病因和基本病机。

中医中药治疗脑梗死一直有其独特的优势，常用的治则治法有清热解毒法、化痰通腑法、平肝熄风法、活血化瘀法、醒脑开窍法等。根据疾病急性期的病理变化，早期予以平肝熄风、清热泻火是很重要的，及至转为痰阻血瘀，再以活血通瘀化痰之法治疗。本研究以天麻通脑颗粒选天麻钩藤饮和通窍活血汤加减化裁而成，共奏平肝熄风、活血化瘀之效〔3〕。此方以川芎、赤芍二药为君，均有活血化瘀之效;天麻、钩藤平肝熄风，制南星、天竺黄清热燥湿化痰，共为臣要;佐以僵蚕、地龙及水蛭，虫类药善动入络，可搜剔经脉，增强清热熄风之功效。旨在平肝熄风与活血化痰共治，使痰化而血行、血行则痰清，气血流畅，以达治疗之效。

现代药理研究表明，川芎、赤芍类活血药能降低血小板活性、抑制其聚集从而促进血液循环;天麻、钩藤可扩张脑动脉和冠状动脉，使血流量增加;制南星等化痰药有降脂作用〔3〕;地龙可抗栓溶栓，抗凝血的同时又不影响止血，用于脑梗死的治疗取得一定的疗效〔12〕;水蛭可抗凝血、抗血栓之用，同时可减少脑梗死后炎性因子的产生，减轻炎性反应，推迟脑细胞的凋亡并改善局部血液循环，从而对缺血脑细胞起到保护作用〔13〕。本研究表明天麻通脑颗粒可以促进脑缺血大鼠神经功能的恢复并对缺血后脑细胞的增殖具有一定疗效。

1 张国瑾，赵增荣.国外脑血管疾病研究进展〔M〕.北京:中医医药科技出版社，2001:21.

2 粟秀初.现代脑血管病学〔M〕.北京:人民军医出版社，2003:117.

3 江淑婷，吴明华.天麻通脑饮治疗急性脑梗塞痰瘀阻络证的临床疗效观察〔J〕.疑难病杂志，2011;5(10):328-30.

4 吴俊芳，刘 忞.现代神经科学研究方法〔M〕.北京:中国协和医科大学出版社，2006:809-61.

5 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989;20(1):84-91.

6 Garcia TH.A reliable method to occlude a middle cerebral in wistar rats〔J〕.Stroke，1993;24(9):1423.

7 Zarow GJ，Karike H，States BA，et al.Endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in rats:effect of suture insertion distance on cerebral blood flow infarct distribution and infarct volume〔J〕.Neurol Res，1997;24(9):409-16.

8 王兆露，殷 勤，成松明，等.经鼻给予碱性成纤维细胞生长因子治疗大鼠脑梗死的研究〔J〕.中国脑血管病杂志，2008;5(10):451-5.

9 王伯沄，王文勇.免疫细胞(组织)化学和分子病理学技术〔M〕.西安:第四军医大学出版社，2010:31-61.

10 潘国庆，罗清平.脑梗死中医治疗方法综述〔J〕.长沙民政职业技术学院院报，2008;15(1):107.

11 国家中医药管理局脑病急症科研组.中风病辨证诊断标准(试行)〔J〕.北京中医药大学学报，1994;17(93):64-5.

12 刘秀艳.地龙的药理研究〔J〕.辽宁中医杂志，2008;35(1):106-7.

13 袁继伟，焦跃军，李晶尧.中药水蛭的药理药效研究〔J〕.中国医疗前沿，2009;4(18):18.