Aβ1～42寡聚体与纤维体的制备及鉴定

杨 帆 李东风 徐书雯 (南方医科大学研究生院，广东 广州 50080)

β淀粉样蛋白(Aβ)毒性学说是阿尔茨海默病(AD)发病的主流学说〔1，2〕。大量的Aβ沉积形成老年斑是AD最具特征性的病理改变〔3〕。已知在 AD老年斑周围聚集活化的小胶质细胞，Aβ可促进小胶质细胞产生如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)等炎症因子〔4，5〕，从而对神经元在内的各种细胞造成损伤甚至凋亡。Aβ以寡聚体或纤维体两种状态存在，这两种状态的Aβ对神经细胞功能损伤的强度不同〔6〕。一般认为，Aβ寡聚体的毒性较纤维体更强，因此，近年来关于AD发病机制的研究一般以寡聚体刺激造模为主。但由于寡聚体的稳定性较差，易向纤维体转化〔7〕，体外研究操作时间窗相对较短，所以使用寡聚体进行实验之前，对其进行鉴定就显得尤为重要，但目前关于Aβ聚集状态的鉴定方法报道较少。为此，本实验先制备不同聚集状态的 Aβ1～42，然后鉴定两种 Aβ1～42形态，进一步证实Aβ1～42聚集形态与神经毒性作用的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠小胶质细胞株(BV2)购自武汉大学的中国典型培养物保藏中心，DMEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司，Aβ1～42购自ENZO公司，肿囊收缩素-8(CCK-8)试剂盒购自日本同仁公司，原子力显微镜(AFM，本原纳米仪器公司，型号CSPM5500)。

1.2 方法

1.2.1 BV-2细胞培养 将BV-2细胞株接种到含10%胎牛血清、高糖DMEM培养基中培养，置于37℃、5%CO2培养箱中孵育，每3 d传代一次，用0.25%胰酶+0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化。

1.2.2 Aβ1～42寡聚体和纤维体的制备 将1 mg Aβ1～42粉末溶于冷却的六氟异丙醇(HFIP)220 μl中，室温孵育60 min使Aβ1～42充分溶解，将Aβ肽-HFIP放置在冰上5～10 min后移至通风橱内，打开瓶盖以便HFIP挥发。风干后形成透明的Aβ肽膜，溶解于44 μl新鲜无水100%二甲基亚矾(DMSO)，制成5 mmol/L Aβ1～42合成肽。

(1)寡聚体制备:用无含酚红的F12培养液将5 mmol/L Aβ1～42合成肽稀释成终浓度 50 nmol/L，4℃ 孵育 24 h 后，以4℃、14 000 r/min 离心 10 min，取上清液即为 Aβ1～42寡聚体，置于-80°C冰箱保存。

(2)纤维体制备:将 5 mmol/L Aβ1～42合成肽溶于10 mmol/L HCl，并稀释成终浓度50 nmol/L，然后放置在37℃温箱孵育24 h即为纤维体，置于-80℃冰箱保存。

1.2.3 AFM鉴定 将Aβ1～42寡聚体和纤维体制成品分别滴于新鲜解离的云母片上，室温下静置5 min后用去离子水轻柔冲洗，干燥皿中干燥10 min。将制备好的 Aβ1～42样品在 AFM下观察，先用接触模式扫描到云母片上的生物制品，再改用轻敲模式进行扫描。轻敲模式参数:力常数40 N/m，共振频率300 kHz，扫描频率1 Hz。图像处理软件为Imager 4.60。

1.2.4 CCK-8细胞存活率测定 在96孔板上以每孔10 000个小胶质细胞种板，加入无血清DMEM/F12高糖培养基培养24 h，然后加入不同浓度Aβ1～42寡聚体和纤维体，共同作用24 h后吸除上清液，每孔加入180 μl培养基L+20 μl CCK-8试剂避光共同孵育，待2 h后通过酶标仪测定450 nm OD值。重复3次。

1.3 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行分析，实验结果以±s表示，采用独立样本t检验。

2 结果

2.1 BV-2小胶质细胞形态 细胞呈两种形态:一种为圆形或椭圆形、折光性强的小细胞，是处于一定活化状态的小胶质细胞;另一种呈不规则胞体，且有细长突起，是处于静息状态的小胶质细胞。见图1。

2.2 AFM鉴定Aβ1～42的不同聚集状态 AFM下不同聚集状态Aβ1～42的形态有差别。Aβ1～42寡聚体呈球状或椭圆球状颗粒，高度为5 nm左右;而Aβ1～42纤维体在镜下呈现长条纤维状聚集，高度约为3 nm左右，长度＞1 000 nm。见图2。

图1 BV-2细胞形态(×400)

图2 AFM鉴定Aβ1～42的聚集状态

2.3 CCK-8法比较不同聚集状态Aβ1～42对BV-2细胞存活率的影响 无论纤维体还是寡聚体，Aβ1～42对BV-2细胞均有损伤作用，并且呈剂量-效应关系。同时，在同样浓度水平的条件下，自0.1 μmol/L浓度起，寡聚体的毒性作用均比纤维体更显著(P＜0.05)。见图3。

图3 不同聚集状态Aβ1～42对BV-2细胞存活率的影响

3 讨论

AD的发病机制迄今未完全清楚，而Aβ毒性学说最受关注。Aβ是由淀粉样前体蛋白水解所产生的多肽，有两种主要存在形式:Aβ1-40和Aβ1～42，共存于老年斑中。在正常情况下，Aβ的产生和降解过程保存平衡，但在AD患者脑中，这种平衡状态受到破坏，导致 Aβ的异常聚集沉积形成老年斑〔8〕。Aβ1～42毒性较Aβ1-40强，更易发生聚集沉积形成老年斑。

研究发现 Aβ1～42的聚集状态与其神经毒性关系密切，Aβ1～42形成可溶性寡聚体时的神经毒性强于其他不可溶性Aβ物质〔9〕。

AFM是一种可用来研究固体材料表面结构的显微镜，其横向分辨率为23 nm，纵向分辨率为0.5 nm。AFM通过检测待测样品表面和一个微型力敏感元件(探针)之间的极微弱的原子间相互作用力来研究物质的表面结构及性质，可以纳米级分辨率获得直观的物体表面结构信息。AFM已成为研究生物医学样品和生物大分子的重要工具之一。近年来，AFM越来越多地被应用于核酸、多肽、蛋白质、微生物和细胞等方面研究。目前常用于鉴定Aβ1～42聚集状态的方法包括有硫磺素T(ThT)荧光光谱分析、电子显微镜等〔10〕。AFM在分辨率方面较电子显微镜更具优势，原子力分辨率最高达到原子级0.1 nm，而扫描电子显微镜达到6～10 nm，且AFM成像可得到三维立体的图像，其样本制作要求比较简单，对环境要求也低。AFM可以在自然状态(空气或者液体)下对生物医学样品直接进行成像。基于AFM的显著优点，本研究尝试应用该手段对Aβ1～42的聚集状态进行鉴定。

AFM的扫描模式可分为非接触模式、接触模式和轻敲模式，因 Aβ1～42为非常柔嫩、易变形的样品，故在本研究中，工作模式先选用接触模式在云母片上扫描到样品后再改用轻敲模式周期性地短暂地接触样品表面进行成像扫描，将对Aβ1～42形态改变的影响降至最小，最大程度呈现Aβ1～42的表面结构。在制备Aβ1～42聚集状态的过程中观察到:Aβ1～42单体溶于 DMSO后，先形成合成肽，经过4℃孵育24 h后形成寡聚体，但随着孵育时间延长至超过48 h后，寡聚体状态渐聚集成纤维体状态，寡聚体在常温状态不稳定，需放置于-80℃保存。因为BV-2细胞表面有其他蛋白物质存在，所以AFM无法在BV-2细胞表面直接观察到Aβ的状态。

Aβ1～42的神经毒性作用非常复杂，可通过多条途径对神经细胞造成不同程度及不同类型的损害，例如可通过氧化应激、炎症反应、干扰胆碱能系统等作用促进神经细胞的凋亡，造成记忆、认知功能的损害。本实验证实Aβ1～42寡聚体比纤维体更具细胞毒性，与先前报道一致〔11，12〕。然而，本实验所证实的Aβ细胞毒性作用是基于体外研究结果，其在AD颅脑内对小胶质细胞的实际作用过程是否完全一致，尚有待进一步研究。

总之，Aβ1～42寡聚体以及纤维体两种不同聚集形态对神经细胞的毒性作用具有显著差异。本研究介绍的AFM鉴定则为此提供了一种简单、直观又准确的手段。

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