高效液相色谱测定山羊瘤胃液挥发性脂肪酸条件优化的研究

苏利红，曹雨莉，李 飞，孙小琴，刘瑞芳

（西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌712100）

反刍动物瘤胃就像一个密闭发酵罐，在动物消化系统中有着重要作用，其对饲料养分的消化吸收依赖于其中微生物动力学过程中产生的大量的挥发性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）。VFA是碳链为1～6的脂肪酸，对动物体代谢作用最为重要的是乙酸、丙酸和丁酸，约占瘤胃发酵VFA总量的95%。VFA是反刍动物能量利用中一个重要的中间代谢产物，其含量及组成比例是反映瘤胃微生物发酵类型和消化代谢活动的重要指标。据报道瘤胃液VFA约可提供反刍动物所需能量的70%［1］。而乙酸、丙酸和丁酸所提供的能量效率不同，所以VFA的比例影响着其供能的总量［2］。瘤胃VFA可使瘤胃维持在一个较理想的酸性环境，适合微生物的繁殖和寄生，这些微生物又进一步通过发酵瘤胃饲料，使瘤胃处于一个良性循环的酸性环境中［3］。VFA还能增加动物血浆中胃动素和胃泌素的水平，从而促进胃的排空，增加胃及上部肠道黏膜细胞的分裂增殖，刺激胃蛋白酶、胰岛素、降钙素的分泌和胆囊收缩。此外，VFA还能有效提高动物肠道抵御病原微生物的能力，其中乙酸和丙酸能抑制志贺菌的生长，高浓度的VFA可以抑制沙门菌和大肠埃希菌的生长。VFA还能帮助动物机体维持肠道黏膜的屏障作用，可以有效预防溃疡性结肠炎和其他炎症。所以，精确测定瘤胃中VFA的含量极其组成比例，不仅为研究瘤胃消化代谢提供重要参数，而且有利于动物疾病的诊治［4］。

VFA传统的测定方法有比色法、滴定法、荧光法及色谱法等，比色法只能测定单一的酸，不能测混合酸；滴定法分析速度较慢，步骤繁琐，容易产生误差，同时，不能将不同种类的挥发性脂肪酸有效分离；荧光法测定VFA的原理是将VFA转化为具有荧光特性的物质，然后通过荧光分光光度计测定VFA的含量，此方法因为需要VFA可以转化成带有强烈荧光特性的物质，因此不能广泛应用；气相色谱法测定VFA样品前处理的方法较繁琐，特别是酯化、萃取酯化等中间步骤需要耗费相当长的时间。总之，建立一种快速、简单、有效的测量VFA的方法是非常有意义的。反相高效液相色谱测量脂肪酸具有快速、预处理简单、分析结果准确等优点，而利用高效液相色谱测定VFA的报道较少［5－7］。高效液相色谱中流动相通常是各种低沸点溶剂和水溶液，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。同时，流动相pH是影响分离效果的一个关键因素。

因此，本试验主要从流动相、pH等方面研究高效液相色谱测定VFA的条件选择和优化。为广泛利用高效液相色谱测定VFA提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器 高效液相色谱分析仪（日立，Hi－tachi L－2000型）；进样器（安捷伦，Agilent 7693A）；精密pH计（赛多利斯，PHS－3C型）。

1.1.2 主要试剂 磷酸、磷酸二氢钾、乙酸、丙酸、丁酸标准品均为分析纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；甲醇、乙腈为高效液相色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；试验用水为超纯水综合系统（PL5124）制得的超纯水。

1.2 方法

1.2.1 样品处理 安装瘤胃瘘管的山羊作为瘤胃液供体，用采样管于晨饲前在瘤胃腹囊中进行样品采集，将采集的样品用4层脱脂纱布过滤，取4mL滤液并加入250mL／L偏磷酸溶液1mL，置－20℃保存。样品解冻后于4℃以19 000r／min离心15min，取上清液过0.22μm滤膜，进样。

1.2.2 色谱条件 色谱柱为 Agilent TC－C18柱（250mm×4.6mm i.d.5μm）；流速为0.6mL／min；进样体积20μL；紫外检测波长210nm；柱温为室温。流动相经0.22μm纤维素膜过滤，超声波脱气。1.2.3 试验分组 本试验流动相设置两个水平，甲醇和乙腈，pH也设置两个水平，2.05和2.30，根据流动相组成和pH，将流动相分为A、B、C、D 4种水平组合（表1）。

表1 不同流动相组成Table 1 Composition of different mobile phases

1.2.4 回收率和精密度的计算 用瘤胃液空白样测定本底值，在瘤胃液空白样中分别加入200mmol／L的标样，检测4种测定条件的回收率，回收率的计算利用以下的公式：

加标回收率＝ （加标试样测定值－试样测定值）÷加标量×100%。

日内精密度：测定同1天内不同时间点4种检测条件下3种VFA的浓度，每个测定项目重复6次，计算其相对标准偏差。

日间精密度：连续3d测定4种检测条件下3种VFA的浓度，每个测定项目重复6次，计算其相对标准偏差。

1.2.5 数据统计与分析 同一样品不同流动相组间比较由t检验完成，结果用¯x±SD表示，显著水平为P＜0.05。统计分析由SPSS 17.0完成。

2 结果

2.1 乙酸、丙酸、丁酸标准曲线及计算结果

精确配制一定浓度乙酸、丙酸和丁酸（33.838、26.498、39.700mmol／L）的混合标样，上样前经过0.22μm的合成纤维素酯膜过滤。以摩尔浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，建立回归方程如表2所示。

表2 高效液相色谱测定乙酸、丙酸和丁酸含量的标准曲线Table 2 Standard curves of content measuring of acetic acid，propionic acid and butanoic acid by high performance liquid chromatography

2.2 乙酸、丙酸、丁酸标准液图谱的采集

利用流动相A、B、C、D对乙酸、丙酸、丁酸标准液进行分离采集图1～图4所示的图谱。根据峰形和保留时间采集图谱，4个不同流动相测定乙酸、丙酸和丁酸标准液的图谱如图1～4所示，图1和图2中，乙酸的出峰时间分别为4.11和4.10，丙酸的出峰时间均为6.64，丁酸的出峰时间均为14.00；图3和图4中，乙酸的出峰时间为3.71，丙酸的出峰时间分别为5.08和5.11，丁酸的出峰时间为8.93和9.01。从这些数据可看出，同种流动相在不同pH条件下标准液（乙酸、丙酸和丁酸）的出峰时间基本一致。

2.3 回收率和精密度的测定

本研究通过测定精密度和回收率对4种检测体系的稳定性和准确性进行了评价。检测结果如表3和表4所示。结果显示，4种检测体系测定VFA的回收率均在90%以上，检测的日内相对标准偏差＜2%，日间相对标准偏差＜10%。这表明4种检测条件检测的准确性和稳定性均能达到VFA检测的要求。

2.4 瘤胃液样品测定

利用甲醇和乙腈作流动相测定瘤胃液中的乙酸、丙酸、丁酸，根据采集的图谱，得知样品中3种酸对应的峰面积和浓度如表5和表6所示。

图1 乙酸、丙酸和丁酸标准样图谱 （流动相A）Fig.1 Standard chromatograms of acetate，propionate and butyrate（Mobile phase A）

图2 乙酸、丙酸和丁酸标准样图谱（流动相B）Fig.2 Standard chromatograms of acetate，propionate and butyrate（Mobile phase B）

图3 乙酸、丙酸和丁酸标准样图谱（流动相C）Fig.3 Standard chromatograms of acetate，propionate and butyrate（Mobile phase C）

图4 乙酸、丙酸和丁酸标准样图谱（流动相D）Fig.4 Standard chromatograms of acetate，propionate and butyrate（Mobile phase D）

表3 不同测定条件下乙酸、丙酸和丁酸检测的回收率Table 3 Recovery of acetic acid，propionic acid and butanoic acid under different test conditions

表4 不同测定条件下乙酸、丙酸和丁酸检测的精密度（n＝6）Table 4 Precision of acetic acid，propionic acid and butanoic acid under different test conditions

表5 瘤胃液样品乙酸、丙酸和丁酸峰面积和浓度Table 5 Peak area and concentration of acetate，propionate and butyrate in rumen fluid sample

表6 不同流动相测定乙、丙、丁酸浓度的比较Table 6 Concentration comparison of acetate，propionate and butyrate with different mobile phases

同一瘤胃液样品在4个流动相下分别采集图谱，并根据图谱的峰面积计算乙酸、丙酸和丁酸的浓度，如表5所示。样品1和样品2是甲醇作流动相时测定的结果，而样品3和样品4是乙腈作流动相时测定的结果。从表5、表6中看出，同种流动相测定样品时，乙酸、丙酸和丁酸的浓度值相近，分别用甲醇和乙腈作流动相测定时，乙酸、丙酸和丁酸的浓度有差异，经显著性检验差异不显著（P＞0.05）。

3 讨论

在高效液相色谱分析中，甲醇和乙腈是两种常用的流动相溶剂。甲醇具有价格低廉的优点，但也存在活性高，容易与样品反应的不足。而且甲醇在低波长下会吸收一定量的紫外线，这些均会降低分析方法的灵敏度。相比较而言，乙腈具有洗脱能力强，不易与待测物反应的优点，但也存在毒性强，价格高的缺点［9］。为了优化高效液相色谱准确检测瘤胃液中3种VFA含量的条件，本研究首先对甲醇和乙腈两种有机溶剂作为流动相对乙酸、丙酸和丁酸的分离效果进行了比较。结果表明甲醇和乙腈均能对3种VFA有效分离，其差异只是体现在出峰时间的不同。这与孙绪顺［10］利用甲醇作流动相的研究结果相一致。

流动相的pH是影响待分析物分离效果的另一个重要因素。赵景婵等认为流动相pH直接决定了VFA以何种形态存在，在检测中只有使流动相pH控制在一定范围内，才能抑制溶质的离子化，减少谱带拖尾、改善峰形，提高分离的选择性［8］。为了摸索最佳pH，宋永康等［11］曾分析了pH 为2.2、2.4、2.5、2.6、2.8、3.0几种流动相对3种酸的分离效果，结果发现以pH＝2.4的流动相分离效果最好。在本研究中，根据实验室前面研究的经验，设置了2.05和2.30两个流动相pH，结果发现在两种pH条件下甲醇和乙腈分离效果相接近，这与白冬梅等［12］的发现是一致的，她们也发现流动相pH为2.2和2.5的流动相对混合酸的分离效果相近。

在液相和气相色谱分析中，精密度和回收率是常用的评价检测体系稳定性和准确性的两个指标。精密度系指在规定的测定条件下，用同一个样品，经多次测定所得各个结果之间的接近程度。由此可见精密度越低检测方法越稳定。而回收率是加标实测的结果减去未加标所测的结果，其差值同加入标准物质的之比即为样品加标回收率。本研究对4种检测体系的稳定性和准确性进行了评价，结果发现4种检测体系日内精密度均小于2%；日间精密度均小于10%，回收率在92%～98%之间。就检测的准确性和重现性而言，4种检测体系均可用于瘤胃液VFA的测定。

结果表明，以甲醇和乙腈做流动相，对3种有机酸均能很好分离，其区别主要体现在出峰时间不同。用乙腈作流动相时，3种酸的出峰时间均比甲醇作流动相时的要短，而且特别是丁酸的出峰时间比用甲醇作流动相时提前5min左右。但考虑到乙腈价格较高，且有毒性，本研究推荐在检测3种有机酸时，如果时间允许，本着经济、安全、环保的考虑建议用甲醇做流动相；如果时间紧，经费宽裕，环保设施到位，建议考虑用乙腈做流动相；与流动相的组成相比，流动相的pH 只要在一定范围内（2.0～2.5），对3种酸的分离效果影响不大。

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