不同强度运动对大鼠骨骼肌PGC－1α表达的影响

郭海峰

（河南科技大学体育学院，河南洛阳471022）

过氧化物酶体增生物受体γ共激活因子－1α（peroxisome proliferator－activated receptorγcoactivator－1α，PGC－1α）是线粒体生物合成、细胞呼吸和能量底物利用的重要调节因子［1］。研究显示在Ⅱ型糖尿病患者及不参加体力活动人群的骨骼肌内PGC－1α蛋白表达量下降［2］，运动能够提高骨骼肌PGC－1α基因和蛋白的表达［3］，而骨骼肌中 PGC－1α的高表达则能大幅提高骨骼肌GLUT4的表达和葡萄糖的转运率［4］。因此，PGC－1α在提高骨骼肌葡萄糖摄取速率以及降低血糖含量方面起着重要的调节作用。

PGC－1α基因的启动子上含有保守肌细胞增强因子2（myocyte enhancer factor 2，MEF2）结合位点和环腺苷酸反应元件（c－AMP response element，CRE）序列［5］，生理刺激条件下此两段序列通过与相应的结合蛋白，即转录因子结合而参与调节PGC－1α的转录［6］。MEF2和CRE位点的变异会抑制运动神经对PGC－1α刺激的响应 ，提示了PGC－1α的转录激活依赖于 MEF2和CRE与PGC－1α启动子的功能性交互作用。转录激活因子2（activating transcription factor－2，ATF－2）和环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cAMP－response element binding protein，CREB）主要通过结合CRE序列而参与调节PGC－1α基因转录［7］。研究显示，骨骼肌内腺苷酸活化蛋白激酶（5′－AMP activated protein kinase，AMPK）和p38丝裂原活化蛋白激酶（p38mitogen－activated protein kinase，p38MAPK）不仅可以直接磷酸化参与调节PGC－1α转录的CRE结合蛋白 AFT－2和CREB，还可以直接磷酸化PGC－1α通过自我调节机制提高PGC－1α启动子的转录激活［8］。以往研究结果显示，骨骼肌能量摄取速率在肌肉活动时有强度依赖性，而相应的信号传导通路也会按照运动的强度被有区别的调节［9］。然而，是否这些信号传导通路有区别的激活会引起下游基因靶分子PGC－1α以及其转录过程呈强度依赖性调节，目前尚不清楚。本研究的目的在于探讨不同强度的急性跑台运动对大鼠骨骼肌PGC－1α表达，以及参与调节PGC－1α表达的信号分子 AMPK、p38MAPK、ATF－2及CREB磷酸化水平的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康8周龄的 Wistar大鼠（178g±4g）48只。试验期间，室内温度保持在20℃～25℃，相对湿度50%～70%，每天光照12h。正常饲养的1周内所有大鼠自由进食和饮水。适应性喂养1周后，大鼠随机分成安静对照组（C）和跑台运动组（E）。其中安静对照组12只，跑台运动组36只。

1.1.2 试验分组 跑台运动组大鼠再随机分为低强度运动组（low intensity exercise group，LE）、中等强度运动组（moderate intensity exercise group，ME）和高强度运动组（high intensity exercise group，HE），每组12只，并分别于试验前按所设计的运动强度和时间进行1次～2次适应性跑台练习。

1.1.3 运动方案设计和取材 跑台训练组大鼠运动方式采用0坡度的1h跑台运动。跑台速度为低强度运动组12m／min（约55%VO2max），中等强度运动组28m／min（约75%VO2max），高强度运动组34m／min（约85%VO2max）［10］。运动组大鼠跑台运动后3h取材（根据预试验结果，蛋白和mRNA表达在运动后3h均显著增加）。腹腔注射乌拉坦（注射标准为5mL／kg体重）麻醉后，取双侧股四头肌，迅速投入液氮中，随后转入－80℃超低温冰箱保存备用。

1.1.4 仪器设备及试剂 PCR扩增仪（GT9631），购自杭州柏恒科技有限公司；RT－PCR试剂盒，Fermentas；7300荧光定量PCR仪和荧光染料反应体系（SYBR○RGreen PCR Master Mix，美国 Applied Biosystems）；蛋白酶抑制剂混合物，购于Pierce公司；BCA蛋白定量试剂盒，购于Pierce公司；一抗［（Phospho－AMPKα （Thr172）， MA； Phosphop38MAPK，Mouse mAb，Cell Signaling Technology；PGC－1α，rabbit polyclonal IgG，Abcam；Phospho－ATF－2Thr172，rabbit monoclonal IgG；Phospho－CREB Ser133，rabbit monoclonal IgG，Cell Signaling Technology］；二 抗 （Goat Anti－rabbit IgG，HRP－linked Antibody，Cell Signaling Technology；Goat anti－mouse IgG，HRP－linked Antibody，上海迪奥公司）；内参（β－actin，rabbit polyclonal IgG，Santa Cruz Biotechnology）。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量PCR 提取骨骼肌总mRNA－肌肉组织80mg于液氮研磨成粉末状，投入装有1mL Trizol（Invitrogen）试剂的离心管中，12 000r／min、4℃离心约10min。取上清400μL至新离心管，于室温静置5min。加入200μL氯仿，混匀，室温放置2min后，12 000r／min、4℃离心30min。取上清移至新离心管，加入等体积异丙醇600μL，混匀，室温放置10min后，12 000r／min、4℃离心10min。弃上清，1mL 700mL／L乙醇（去DEPC水配制）漂洗沉淀后，7 500r／min、4℃离心5min。弃去70mL／L乙醇，超净台自然风干，加20μL DEPC水溶解沉淀。8g／L琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计测定RNA完整性以及浓度和纯度。

对于PGC－1αmRNA的表达，本试验采用实时荧光定量（Real－time PCR）两步法进行。第一步，逆转录（RT）部分。使用PCR扩增仪和RT－PCR试剂盒，按照RecertAid First Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行逆转录反应。合成的cDNA于－20℃冰箱储存备用（mRNA不稳定，所以该步骤要在取材后3d内完成）。荧光定量检测部分使用7300荧光定量PCR仪和荧光染料反应体系。用引物设计软件设计，由宝生物工程（大连）有限公司合成。具体上、下游引物序列为：PGC－1αa，5′－ACGGGATGTGGTAGATCGTG－3′；PGC－1αs，5′－GGCGACGTTAGTAAGTGGCT－3′。实时荧光定量数值由StepOne实时荧光定量PCR系统（Applied biosystems）读取。目标基因＝2－△△CT。

1.2.2 Western blot 骨骼肌 Phospho－AMPKα、Phospho－p38MAPK、PGC－1α 等 蛋 白 表 达 采 用Western blot测定。股四头肌大约100mg置于1mL蛋白裂解液中（50mmol／L Tris－HCl，pH 7.4～8.0，150mmol／L NaCl，5mmol／L EDTA，10g／L Triton－X－100，5μL 100×蛋白酶抑制混合物），4℃条件下电动匀浆机充分匀浆后，4℃、14 000r／min离心5min后，取上清保存于－80℃。采用Pierce公司的BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。

依据蛋白含量调整蛋白上样量后，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离目的蛋白（p－AMPKα、pp38、PGC－1α等）和内参蛋白（β－actin），转移至硝酸纤维素膜（Millipore），采用50g／L的脱脂奶粉封闭50min，一抗4℃过夜。二抗和内参孵育1h，洗涤，然后X光片（Kodak）暗室曝光、显影、定影。用生物电泳图像分析软件（FR－980Smart View，复日科技）对曝光所得X片进行拍照，使用Quality one软件读取目的蛋白和内参蛋白条带的积分灰度值，结果用目的蛋白积分灰度值与内参积分灰度值的比值表示。

1.2.3 数据统计 试验数据均以平均数±标准差（¯x±SD）表示。数据分析使用SPSS 15.0分析软件。同一指标之间比较采用单因素方差分析。显著性水平用P＜0.05和P＜0.01为表示。

2 结果

2.1 PGC－1αmRNA表达

由图1看出，一次性不同强度跑台运动后，大鼠骨骼肌PGC－1αmRNA表达与对照组相比均显著增加，差异极显著（P＜0.01）。中等强度运动组大鼠骨骼肌PGC－1αmRNA表达显著高于低强度运动组（P＜0.05），高强度运动组大鼠骨骼肌PGC－1αmRNA表达与中等强度运动组相比，差异极显著（P＜0.01）。

图1 一次性跑台运动对PGC－1αmRNA表达的影响Fig.1 The effect of a bout of exercise on PGC－1αmRNA expression

2.2 骨骼肌内PGC－1α蛋白表达

由图2看出，一次性不同强度跑台运动后，大鼠骨骼肌PGC－1α蛋白表达与对照组相比均显著增加。中等强度运动组大鼠骨骼肌PGC－1α蛋白表达与低强度运动组相比没有显著性差异（P＞0.05）；高强度运动组大鼠骨骼肌PGC－1α蛋白表达显著高于中等强度运动组（P＜0.01）。

2.3 骨骼肌 AMPKα（Thr172）磷酸化水平

由图3看出，一次性不同强度跑台运动后，大鼠骨骼肌内AMPKα磷酸化水平与对照组相比均显著升高，且均呈极显著性差异（P＜0.01）。中等强度运动组大鼠骨骼肌AMPKα磷酸化水平显著高于低强度运动组（P＜0.05）；高强度运动组大鼠AMPKα磷酸化水平与中等强度运动组相比，呈极显著性差异（P＜0.01）。

图2 各组大鼠骨骼肌PGC－1α蛋白表达Fig.2 Protein expression of PGC－1αin skeletal muscle of rats of various groups

图3 各组大鼠骨骼肌AMPKα（Thr172）磷酸化水平Fig.3 Phosphorylatiion levels of AMPKα（Thr172）in skeletal muscle of rats of various groups

2.4 骨骼肌p38MAPK蛋白磷酸化水平

由图4看出，一次性不同强度跑台运动后，大鼠骨骼肌内p38MAPK磷酸化水平与对照组相比均显著升高，且均呈极显著性差异（P＜0.01）。不同强度运动组大鼠p38MAPK磷酸化水平相比均无显著性差异（P＞0.05）。

图4 各组大鼠骨骼肌p38MAPK磷酸化水平Fig.4 Phosphorylatiion levels of p38MAPK （PP38）in skeletal muscle of rats of various groups

2.5 骨骼肌ATF－2磷酸化水平

由图5看出，一次性不同强度跑台运动后，虽然低强度运动组大鼠骨骼肌ATF－2磷酸化水平与安静对照组相比没有显著性差异，中等强度和高强度运动组大鼠骨骼肌ATF－2磷酸化水平与安静对照组相比均显著升高。中等强度运动组大鼠骨骼肌ATF－2磷酸化水平显著高于低强度运动组（P＜0.05）；高强度运动组大鼠骨骼肌ATF－2磷酸化水平显著高于中等强度运动组（P＜0.05）。

图5 各组大鼠骨骼肌ATF－2磷酸化水平Fig.5 Phosphorylatiion levels of ATF－2in skeletal muscle of rats of various groups

2.6 骨骼肌CREB磷酸化水平

由图6看出，一次性不同强度跑台运动后，虽然低强度运动组大鼠骨骼肌CREB磷酸化水平与安静对照组相比没有显著性差异，中等强度和高强度运动组大鼠骨骼肌CREB磷酸化水平与安静对照组相比均显著升高。中等强度运动组大鼠骨骼肌CREB磷酸化水平显著高于低强度运动组（P＜0.05）；高强度运动组大鼠骨骼肌CREB磷酸化水平与中等强度运动组相比没有显著差异（P＞0.05）。

图6 各组大鼠骨骼肌CREB磷酸化水平Fig.6 Phosphorylatiion levels of CREB in skeletal muscle of rats of various groups

3 讨论

3.1 不同强度运动对PGC－1α表达的影响

PGC－1最先是采用酵母双杂交技术从小鼠的棕色脂肪组织中发现的，因为它可以促进PPARγ的转录，因此得名过氧化物酶体增生物激活受体γ共激活因子1。目前发现的PGC－1家族成员有PGC－1α、PGC－1β和 PGC－1相关共激活因子（PGC－1－related coactivator，PRC）。PGC－1α在能量代谢主要场所及富含线粒体的骨骼肌中高表达。研究显示PGC－1α可以通过协同激活肌细胞增强因子MEF2高效诱导GLUT4基因的表达而提高肌细胞转运葡萄糖的能力，从而降低血糖 。由此可见，PGC－1α的表达下降，必然引起GLUT4表达的下降，导致葡萄糖转运功能缺陷，血糖升高。

大量研究表明，运动可以促进PGC－1α基因和蛋白的表达，这对于改善胰岛素水平及降低糖尿病人血糖浓度等方面有着重要的意义。David C W等［11］的研究发现大鼠6h游泳运动后，骨骼肌PGC－1α蛋白含量显著增加。Terada A S等［12］让大鼠进行每次3h、中间休息45min总共6h的跑台运动后发现，四头肌PGC－1α蛋白表达量增加了75%。本试验中大鼠1h一次性不同强度跑台运动后，骨骼肌PGC－1αmRNA和蛋白表达量与对照组相比均显著增加，与以往研究结果相一致。另有研究报道显示运动引起的PGC－1αmRNA表达增加具有时相性［13］。通常表现为一次性运动后，PGC－1αmRNA即刻增加，运动后3h显著增加，运动后15h才达到顶峰，运动后18h与安静对照相比仍有显著性差异。

虽然目前关于运动对PGC－1α的影响研究比较成熟，但目前研究多集中于不同的运动形式对运动后的时相性变化规律，而关于运动强度是否对运动后骨骼肌PGC－1α表达产生影响，目前尚不清楚。本研究假设大鼠不同强度的跑台运动后PGC－1α基因和蛋白表达量增加量由于运动强度的差异而各不相同。研究结果显示，中等强度运动组大鼠骨骼肌PGC－1αmRNA表达显著高于低强度运动组，高强度运动组大鼠骨骼肌PGC－1αmRNA表达与中等强度运动组相比，呈极显著性差异，与我们试验假设运动引起的PGC－1α表达增加具有强度依赖性相一致。另外，虽然高强度运动组大鼠骨骼肌PGC－1α蛋白表达显著高于低强度运动组，而中等强度运动组大鼠骨骼肌PGC－1α蛋白表达与低强度运动组相比没有显著性差异，其原因尚不明确。但有研究报道称，由于细胞蛋白表达受多重调节步骤的限制（如基因转录、mRNA的稳定性、蛋白翻译效率、蛋白翻译的修饰及蛋白降解等），同一运动模型中能量代谢蛋白表达通常要晚于基因转录［14］。本研究在运动后3h取材，PGC－1α蛋白的含量增加可能并没有到达稳定增加的时间范围。

3.2 不同强度运动对p38磷酸化水平的影响

近年来有研究发现，p38可以直接磷酸化PGC－1，并引起PGC－1转录活动的抑制剂－p160结合蛋白释放，使PGC－1活动增强，而抑制p38活性则会阻断运动诱导的PGC－1表达。虽然这些研究结果提示了p38是PGC－1的上游激酶，但是一直没有证据表明p38可以促进骨骼肌PGC－1α基因转录以及蛋白表达。直到2005年，Akimoto T等［15］利用高表达转基因技术，发现在C2C12肌肉细胞中高表达p38，能引起细胞内PGC－1转录活性的增强。研究人员推测p38的激活可能通过磷酸化ATF－2，然后ATF－2结合并激活PGC－1启动子上的CRE结合位点，诱导PGC－1表达增加。而David C等［16］的研究结果表明大鼠游泳运动后，p38磷酸化和ATF－2磷酸化水平均显著增加，可能为此推测提供了进一步的证据。

研究表明，不论是急性运动，还是耐力性运动都能显著激活p38［15］。本试验发现，一次性不同强度跑台运动后，大鼠骨骼肌内p38磷酸化水平与对照组相比均显著升高，且均呈非常显著性差异，与前人研究结果一致。但本试验中不同强度运动组大鼠骨骼肌内p38磷酸化水平相比，并无显著性差异，提示p38对运动强度的敏感性较差。不同强度运动后p38的磷酸化水平与PGC－1αmRNA的表达及蛋白表达水平并不一致，则可能进一步提示了虽然p38参与调解了运动后骨骼肌PGC－1α表达的增加，但并不是影响运动后PGC－1α表达呈强度依赖性的主要上游激酶。

3.3 不同强度运动对AMPK磷酸化水平的影响

AMPK作为细胞内能量代谢的感受器，有学者发现［17］，利用 AMPK 药理激活剂5－氨基咪唑－4－甲酰胺核苷酸（5－amino－4－imidazolecarboxamide－riboside，AICAR）孵育大鼠骨骼肌细胞后PGC－1αmRNA表达显著升高，且这种增加在AMPK基因敲除鼠受到抑制，提示AMPK同样参与调控PGC－1α表达。研究显示PGC－1α启动子含有保守性MEF2结合位点，MEF2通过结合到PGC－1α启动子区域MEF2结合位点而调节PGC－1α的转录。安静状态下，MEF2与组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylases，HDACs）的结合抑制了MEF2对靶基因－PGC－1α的转录活性［18］。但是 HDACs的磷酸化可以解除其对MEF2的抑制，使MEF2发挥其对靶基因－PGC－1α的生理作用。骨骼肌内AMPK在骨骼肌中激活以后正是通过磷酸化HDAC4和HDAC5来解除对MEF2的抑制，实现其对PGC－1α转录的调节。

关于运动对AMPK活性的影响，目前研究结果一致认为运动能够提高AMPKα磷酸化水平。本试验发现一次性跑台运动后，与对照组相比，骨骼肌内AMPKα磷酸化水平均增加，呈非常显著性差异，与以往研究结果相一致。另外，试验发现中等强度运动组大鼠骨骼肌AMPKα磷酸化水平显著高于低强度运动组，高强度运动组大鼠AMPKα磷酸化水平与中等强度运动组相比，呈非常显著性差异，提示运动引起的骨骼肌内AMPK激活增加同样受运动强度影响。

3.4 不同强度运动对ATF－2和CREB磷酸化水平的影响

ATF－2和CREB均属于CRE转录因子家族成员，两者均与 CRE 序列 （5′－TGACGTCA －3′）有极高的亲和力，并通过与之结合而调节PGC－1α的转录。有研究显示ATF－2的磷酸化主要是由p38介导，即p38对PGC－1α的调节是通过调节ATF－2与PGC－1α启动子上的CRE结合位点结合发挥生理作用，这一途径对于运动诱导的PGC－1αmRNA表达增加至关重要。肌肉收缩或运动均伴随有p38和ATF－2的激活以及PGC－1αmRNA表达增加。因此，推测运动引起的PGC－1αmRNA表达增加可能依赖于p38对ATF－2的磷酸化水平的调节作用。

本试验结果显示，虽然低强度运动组大鼠骨骼肌内ATF－2磷酸化水平与安静对照组相比不具有显著性差异；但中等强度和高强度运动后大鼠骨骼肌ATF－2磷酸化水平与安静对照组相比均显著增加，且中等强度运动组大鼠骨骼肌ATF－2磷酸化水平显著高于低强度运动组，高强度运动组骨骼肌ATF－2磷酸化水平显著高于中等强度运动组，提示运动引起的ATF－2的激活同样受运动强度影响。低强度运动组与安静对照组相比，大鼠骨骼肌内ATF－2磷酸化水平没有显著性差异，则提示了机体可能还有其他信号通路在中强度和高强度运动下激活了ATF－2，而不是p38，具体机制尚不明确，但是足以证明ATF－2在运动后PGC－1α强度依赖性增加过程中起重要调节关键作用。

CREB是细胞内的第三信使，定位于细胞核内，其C端包含有一个亮氨酸拉链区，是CREB分子与DNA相互作用的区域，称亮氨酸拉链结构域（bZIP），也称DNA结合结构域。研究显示CREB蛋白的生物学活性受其磷酸化的调控，它是多种蛋白激酶的磷酸化底物，包括AMPK、p38。当CREB蛋白被磷酸化后，可以被CBD蛋白特殊的结构域特异性地识别并结合，并促使PGC－1α启动子序列上的CRE元件的乙酰化，启动基因转录。由于AMPK、P38作为已经发现并证实的CREB上游激酶在运动中均能够被激活，因此，推测AMPK以及p38可能通过磷酸化CREB来调节运动后PGC－1α基因的表达。

研究结果显示，一次性不同强度跑台运动后，虽然低强度运动组骨骼肌CREB磷酸化水平也有所增加，但并不显著；虽然中等强度和高强度运动组大鼠骨骼肌CREB磷酸化水平与安静对照组相比均显著升高，但高强度运动组大鼠骨骼肌CREB磷酸化水平与中等强度运动组相比没有显著差异。这些结果提示，CREB磷酸化水平可能并不是影响运动后PGC－1α呈强度依赖性增加的主要因素。有研究发现运动后19hCREB磷酸化状态仍然保持高水平［19］，这可能是维持运动18h后PGC－1αmRNA高水平的主要原因 。本试验最终研究表明，运动引起的PGC－1α表达增加具有强度依赖性；运动后PGC－1α呈强度依赖性增加可能主要受同样具有强度依赖性的AMPK以及ATF－2调节；虽然以往研究显示p38及CREB的激活也参与调节了运动后PGC－1α的表达的增加，但可能并不是影响运动后PGC－1α呈强度依赖性增加的主要因素。

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