水牛IFN－γ在毕赤酵母中的表达及其单克隆抗体的制备

邹新峰，郭爱珍＊，陈颖钰，胡长敏，王 冰，刘晓乐，谢 倩，姜 勇，张 策，陈焕春

（1.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，湖北武汉430070；2.华中农业大学动物医学院，湖北武汉430070；3.华中农业大学动物科技学院，湖北武汉430070）

γ干扰素（interferon－γ，IFN－γ）是一种多功能生物活性多肽，具有抗感染、抗肿瘤活性和免疫调节等作用，如活化巨噬细胞、提高 MHCⅠ类和 MHCⅡ类分子的表达、促进抗原提呈等，在机体抗感染与免疫中发挥重要作用［1］。基于IFN－γ与感染之间的密切联系，医学及兽医学上常利用检测IFN－γ进行传染病诊断［2］。该方法灵敏度与特异性较高，显示出很大的应用前景［3－6］，其基本原理是曾经感染或发过病的人或动物，其T淋巴细胞被该病原如结核分支杆菌致敏，当在体外再次遇到相同抗原时，T淋巴细胞将在短时间内再激活产生大量IFN－γ，因此，通过检测特异性抗原刺激后T细胞分泌的IFN－γ水平即可判断动物是否感染过该病原。该原理在黄牛或人结核检测上得到应用，如人结核ELISPOT试剂盒、BOVIGAM®牛分支杆菌γ干扰素检测试剂盒等已有商品上市。但水牛尚无类似试剂盒可用。

据联合国粮农组织（FAO）统计，2009年全世界有水牛18 792万头，97%分布在亚洲（18 244万头），水牛数量位于前三位的国家是印度（10 663万头）、巴基斯坦（2 988万头）和中国（2 328万头）。水牛耐粗抗逆，是我国南方宝贵的品种资源，目前正由役、奶、肉兼用向肉或奶专用方向发展，且产业化程度不断提高，因此研发其新型疾病诊断技术具有重要意义。本研究通过克隆和真核表达水牛IFN－γ，制备单克隆抗体和多克隆抗体，建立灵敏度和特异性较高的水牛IFN－γ检测方法，为进一步研发水牛特异性疫病诊断技术奠定良好基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

各种限制性内切酶，T4DNA连接酶，DNA分子质量标准品均为宝生物工程（大连）有限公司产品；2×PCR Mix为广州东盛生物科技有限公司产品；逆转录酶ReverTra Ace为ToyoCer公司产品；原核表达的水牛IFN－γ蛋白、奶牛IFN－γ蛋白（BovIFN－γ）、梅 花 鹿 IFN－γ 蛋 白 （CerIFN－γ）、猕 猴IFN－γ蛋白（Macaque IFN－γ，macIFN－γ）、糖蛋白gG、结核分支杆菌特异性融合蛋白CFP10－ESAT6（CE）、Rv3872－CFP10－ESAT6 （RCE）、MPB70－MPB83－CFP10－ESAT6（70－83－CE）、牛无乳链球菌Sip蛋白、牛无乳链球菌和金黄色葡萄球融合蛋白Sip－Clfa、牛无乳链球菌 Gapc蛋白、pET－30a载体、大肠埃希菌（E.coli）感受态菌DH5α、表达菌BL21（DE3）均由本实验室保存；刀豆球蛋白A（Con A）、羊抗鼠IgG－HRP、羊抗兔IgG－HRP均为Sigma公司产品；RPMI－1640培养基为 Hyclone公司产品；DMEM培养基为Gibco公司产品；胎牛血清为美国Gibcol公司产品。

SPF级雌性Balb／c小鼠及雄性日本长耳大白兔，购自湖北省疾病控制中心实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 水牛IFN－γ成熟肽基因的克隆 根据Gen－Bank上发布的水牛IFN－γmRNA全长序列（Gen－Bank登录号：EF567075），用信号肽预测软件SignalP 3.0Server预测信号肽，针对去除信号肽的成熟肽序列设计一对引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列如下：

上 游 引 物：5′－CGCGAATTCCAGGGCCAATTTTTTAGAG－3′（下划线为无关碱基）；

下 游 引 物：5′－ATAGCGGCCGCCATTGATGCTCTCCGG－3′（下划线为无关碱基）。

无菌采取本地江汉水牛、摩拉杂交水牛颈静脉肝素抗凝血10mL，加ConA 60μg／mL于37℃体积分数为5%CO2条件下培养16h。提取外周血白细胞总RNA作为RT－PCR的模板，一步法扩增本地水牛与摩拉杂交水牛IFN－γ成熟肽序列429 bp［2］。将本地水牛与摩拉杂交水牛的IFN－γ扩增片段送华大基因公司测序鉴定。

根据测序结果，通过密码子优化网站http：／／www.jcat.de／Start.jsp，将水牛IFN－γ密码子替换为毕赤酵母最偏爱密码子，命名为BbIFN－γ（优），上游加上EcoRⅠ位点、下游分别加上6×His、终止子TAGTAA、NotⅠ位点，并合成全基因优化后的序列，连于pUC57载体上。通过限制性内切酶EcoRⅠ、NotⅠ双酶切将该基因连接到酵母表达载体pPICZαA中，构建的重组质粒命名为pPICZαA－Bb－IFN－γ（优）。转化感受态细菌DH5α。

1.2.2 毕赤酵母的转化与鉴定 取5μg～10μg重组表达质粒pPICZαA－BbIFN－γ（优），限制性内切酶SacⅠ酶切线性化后，用普通DNA产物纯化试剂盒进行纯化，最后用无菌去离子水洗脱。线性化质粒电击转化毕赤酵母GS115，在500μg／mL Zeocin YPD平板上30℃孵化2d～3d，筛选高拷贝转化子，阳性转化子在平板上应为乳白色酵母菌落。电击参数为电压2 000V，电容25μF，电阻200Ω。

用PCR鉴定阳性转化子，引物为酵母载体通用引物，序 列 为：5′－AOX1（GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC）和 3′－AOX1（GCA AAT GGC ATT CTG ACA TCC。用酵母基因组DNA提取试剂盒提取酵母基因组作为模板，进行PCR鉴定，阳性转化子可获得2 200bp（由酵母染色体DNA扩增而得）和580bp＋467bp目的片段 （由插入至酵母基因组DNA中含有目的基因的表达盒DNA扩增而得）的扩增产物。

1.2.3 水牛IFN－γ基因的诱导表达和产物鉴定挑选一单菌落，置于25mL BMGY培养基中，28℃、250r／m培养至 OD600nm＝2.0左右（16h～18 h）；离心弃上清，用50mL BMMY重悬菌体，使OD600nm＝1.0左右（约50mL）；用甲醇连续诱导4d，在诱导过程中，每24h加入甲醇至终浓度为10 mL／L，并每隔一段时间取样一次（如0、24、48、60、72、84、96h）。样品经离心收集上清并用TCA（三氯乙酸）浓缩，150g／L SDS－PAGE（分离胶浓度为150g／L）鉴定重组蛋白各个诱导时间的表达量情况［8］。

1.2.4 重组水牛IFN－γ的抗病毒活性鉴定 利用微量细胞病变抑制法［9］，采用牛肾细胞系细胞（madin－darby bovine kidney，MDBK）－水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）系统（MDBKVSV）检测干扰素的抗病毒活性。将MDBK细胞铺于96孔细胞培养板中，待细胞长至孔底的80%左右时，弃原孔培养液，再在每孔中加不同稀释度的酵母表达的重组BbIFN－γ蛋白或原核表达的重组BbIFN－γ蛋白（本实验室保存）100μL（原蛋白浓度0.238mg／mL），孵育24h后，加入100TCID50的VSV。同时设不加重组BbIFN－γ蛋白、不加病毒、不加重组BbIFN－γ蛋白和病毒的3个对照组。2d后在显微镜下观察细胞病变。将能抑制50%细胞病变时干扰素的最大稀释度定义为1个干扰素活性单位（U），比活性为每mg蛋白含有的活性单位数。

1.2.5 水牛IFN－γ单克隆抗体及多克隆抗体制备

重组IFN－γ与等体积弗氏完全佐剂混合乳化完全，选取4周龄～6周龄的雌性Balb／c小鼠5只，按100μg／只皮下多点注射进行免疫，以后每2周免疫一次，从第2次免疫起，抗原蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合乳化，免疫3次～4次，用间接ELISA检测小鼠血液抗体水平，当抗体效价达到1∶10 000以上时，间隔1个月后，选取抗体水平较高的Balb／c小鼠于融合前3d腹腔注射加强免疫，抗原量加倍，不加佐剂。

按传统方法进行脾细胞制备与细胞融合［7］。将加强免疫的Balb／c小鼠，摘除眼球放血，颈椎脱臼法处死，按无菌操作取出脾脏，分离免疫小鼠脾细胞，加入非免疫小鼠的腹腔巨噬细胞作为滋养细胞。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞SP2／0以10∶1比例混匀于50mL尖底离心管中，1 500r／m离心10 min，保留细胞沉淀。于37℃水浴中，在1min内慢慢加入0.8mL预温至37℃的50%PEG4000，边加边轻轻搅拌。加毕，静置1min，然后慢慢加入10 mL预温至37℃的RPMI－1640基础培养基。1 000 r／m离心5min，保留细胞沉淀，37℃ 放置5min～8min。用含有饲养细胞的HAT培养基悬浮细胞沉淀，均匀滴加至4块96孔细胞培养板中，约250 μL／孔。置于体积分数为5%CO2，37℃ 培养箱中培养。第4天补加1滴HAT培养基，第8天到第10天每孔吸去100μL培养基后，添加100μL HT培养基。待细胞集落长至视野1／4～1／2时，即可进行抗体检测。

以BbIFN－γ融合蛋白检测杂交瘤细胞上清抗BbIFN－γ单克隆抗体滴度，筛选阳性克隆孔，进一步用有限稀释法将阳性克隆孔细胞克隆3次后筛选能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，通过杂交瘤细胞染色体计数鉴定杂交瘤细胞的特征。按常规方法制备腹水，用辛酸－硫酸铵法进行腹水单克隆抗体的提取与纯化［10］。

同时，将纯化的BbIFN－γ按以上程序免疫两只2.0kg以上体重的雌性日本长耳大白兔，抗原免疫剂量为1 000μg／只，每2周免疫一次，每次免疫前用间接ELISA测定血清抗体效价，当血清效价不再上升时，心脏采血，分离血清，利用辛酸－硫酸铵法纯化多克隆抗体［10］。

1.2.6 水牛IFN－γ体外释放方法的建立

1.2.6.1 水牛IFN－γ单／多克隆抗体最佳工作浓度的确定 利用方阵滴定确定最佳工作浓度，基本程序按照本实验室常规方法。BbIFN－γ单克隆抗体分别以10μg／mL、5μg／mL、2.5μg／mL、1.25μg／mL、625 ng／mL、313ng／mL、156ng／mL、78ng／mL 8个梯度，纵向按每孔100μL包被96孔ELISA板，每稀释度1孔，4℃包被过夜。次日用 PBST（含0.5mL／L Tween－20）充分洗涤后加入50g／L脱脂奶粉37℃封闭1h。固定夹心抗原BbIFN－γ的浓度（本试验设1 000、200、50、1ng／mL 4个浓度），每孔100μL，37℃孵育30min后充分洗涤。BbIFN－γ多克隆抗体分别以5μg／mL、2.5μg／mL、1.25μg／mL、625ng／mL、313ng／mL、156ng／mL 6个梯度横向按每孔100μL量加入ELISA板，每稀释度1孔，37℃孵育30min后充分洗涤。加1∶5 000稀释的羊抗兔IgG－HRP，每孔100μL，37℃孵育30min，充分洗涤后每孔100μL TMB／H2O2底物液，室温避光反应10min后，每孔加入50μL终止液（2.5mL／L氢氟酸）终止反应，读取波长630nm的光密度值（OD）。

1.2.6.2 水牛IFN－γ单克隆抗体敏感度的测定 根据上述方阵滴定方法得到的单抗2C3的最适包被浓度包被96孔酶标板，100μL／孔，4℃包被过夜。次日用PBST充分洗涤后加入50g／L脱脂奶粉37℃封闭1h。PBST充分洗涤后，用洗涤液递增稀释抗原（Bb－IFN－γ标准品），稀释后为2μg／mL、1μg／mL、500 ng／mL、250ng／mL、125ng／mL、62.5ng／mL、31.25 ng／mL、15.6ng／mL、7.8ng／mL、3.9ng／mL、2.0 ng／mL、1.0ng／mL、500pg／mL、250pg／mL、125 pg／mL 15个梯度，37℃孵育30min，重复洗涤。用洗涤液稀释到确定的多克隆抗体工作浓度，每孔100 μL，37℃孵育30min后充分洗涤。加1∶5 000稀释的羊抗兔IgG－HRP，每孔100μL，37℃孵育30min，充分洗涤后每孔100μL TMB／H2O2底物液，室温避光反应10min后，每孔加入50μL终止液 （2.5 mL／L氢氟酸）终止反应，读取波长630nm的光密度值（OD）。

1.2.6.3 水牛IFN－γ单克隆抗体特异性的测定 用确定的水牛IFN－γ单／多克隆抗体最佳工作浓度，分别检测牛IFN－γ（bovine IFN－γ，bov IFN－γ）、鹿IFN－γ（Cervus nippon IFN－γ，CerIFN－γ）、猴IFN－γ（Macaque IFN－γ，mac IFN－γ）、gG、CE、RCE、70－83－CE、Sip、Sip－Clfa、Gapc等抗原，验证单抗的特异性。

2 结 果

2.1 水牛IFN－γ基因的克隆与鉴定

以ConA刺激16h的本地水牛、摩拉杂交水牛全血淋巴细胞中提取的总RNA为模板，通过RTPCR扩增出一条预期大小（429bp）的特异性目的条带（图1）。

图1 BbIFN－γ基因的RT－PCR产物Fig.1 RT－PCR products of BbINF－γgenes

本地江汉水牛与摩拉杂交水牛的IFN－γ成熟肽扩增片段测序结果完全一致，说明本地水牛和摩拉杂交水牛虽然染色体数不同，但其IFN－γ的序列是一致的，测序结果与GenBank中公布的广西沼泽型水牛IFN－γ序列同源性为99%。

将优化后的序列连接于毕赤酵母表达载体pPICZαA，构建了重组表达质粒 pPICZαA－BbIFN－γ（优），经限制性内切酶EcoRⅠ、NotⅠ双酶切，获得一条500bp的条带，与BbIFN－γ基因的大小相符（图2）。

图2 重组质粒pPICZαA－BbIFN－γ的酶切鉴定Fig.2 Identification of pPICZαA－BbIFN－γby enzyme digestion

2.2 重组水牛IFN－γ的酵母表达与鉴定

将重组表达质粒pPICZαA－BbIFN－γ（优）转化毕赤酵母GS115，筛选高拷贝表达株并经甲醇连续诱导4d，将各诱导时间所取的1mL上清经三氯醋酸（Trichloroacetic acid，TCA）浓缩20倍进行SDSPAGE电泳，考马斯亮蓝染色表明，重组BbIFN－γ在毕赤酵母中得到高效表达，并在诱导84h时表达量达到最高（图3），Western blot证实重组BbIFN－γ具有反应原性（图4）。

图3 多拷贝重组酵母表达上清的SDS－PAGEFig.3 SDS－PAGE of supernatants of multicopy recombinant yeast

图4 重组BbIFN－γ酵母表达产物的Western blot检测Fig.4 Detection of recombinant BbIFN－γwith Western blot assay

2.3 水牛IFN－γ抗VSV试验

采用VSV－MDBK系统，利用纯化好的原核表达蛋白和重组酵母表达蛋白BbIFN－γ，检测两种表达系统得到的BbIFN－γ抑制VSV在MDBK细胞增殖的作用并作比较，结果表明原核表达的BbIFN－γ抗VSV病毒效价为2.05×105U／mL，比活性为7.07×105U／mg；酵母表达的BbIFN－γ抗 VSV病毒效价为7.44×105U／mL，比活性为3.13×106U／mg。

2.4 水牛IFN－γ单克隆抗体、多克隆抗体的制备

将纯化的BbIFN－γ蛋白免疫小鼠，4次免疫后，血清中抗BbIFN－γ抗体的ELISA效价高于2.56×104。用纯化的BbIFN－γ蛋白筛选阳性杂交瘤克隆细胞，三次有限稀释克隆后获得5株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，将其分别命名为1C3、2C3、3E7、4G6和4H4。进一步以杂交瘤细胞诱生小鼠腹水，ELISA 检测1C3、2C3、3E7、4G6和4H4的腹水抗体的效价分别为2.56×104、5.12×104、1.28×104、2.56×104、5.12×104（图5）。染色体计数，SP2／0瘤细胞的染色体平均数为70，脾细胞染色体数为40，而杂交瘤细胞的染色体数目在100～110之间，均高于两亲本细胞的染色体数目，证实这3株细胞均为杂交瘤细胞。通过亚型鉴定，3株单抗均为IgG1型。

同样检测免疫兔的高免血清效价，经过五次免疫的日本大耳白兔，产生的抗BbIFN－γ抗体效价为1.024×105。

2.5 双抗体夹心ELISA方法的建立

2.5.1 单抗最适包被浓度和夹心抗体最适工作浓度的确定 通过固定蛋白浓度，纯化的单抗2C3和纯化后的多抗做方阵滴定，以确定单抗最适包被浓度和夹心抗体最适工作浓度。当蛋白浓度为50 ng／mL时，方阵滴定出现明显的滴定效果。选取OD630nm值大幅下降的孔作为判定孔，将此孔对应的单抗和多抗的前一个稀释浓度，即可判定为它们的工作浓度，确定单抗的包被浓度为125ng／孔，稀释3 816倍（原浓度4.77mg／mL），多抗的工作浓度为125ng／孔，稀释1 680倍（原浓度2.1mg／mL）（表1）。

表1 方阵滴定确定重组水牛IFN－γ抗体的ELISA最佳工作浓度Table 1 Optimization of working concentrations for antibodies to BbIFN－γby crossboard titration with ELISA

2.5.2 双抗体夹心ELISA检测水牛IFN－γ的敏感度 用确定的单抗与多抗的最佳工作浓度做双抗体夹心ELISA，检测BbIFN－γ的敏感度。将单抗稀释3 800倍稀释后按100μL／孔包被（即125ng／孔包被），加入16个浓度梯度的BbIFN－γ，再将多抗1 680倍稀释后按100μL／孔（即125ng／孔）加入，最后加入1∶5 000的羊抗兔的酶标二抗，结果表明，检测BbIFN－γ的敏感度达到125pg／mL。

2.5.3 双抗体夹心ELISA检测水牛IFN－γ的特异性 用确定的水牛IFN－γ单／多克隆抗体最佳工作浓度，分别检测 BovIFN－γ、CerIFN－γ、猴IFN－γ、gG、CE、RCE、70－83－CE、Sip、Sip－Clfa、Gapc等 抗原，结果均为阴性反应，证明五株单抗特异性良好（表2）。

表2 夹心ELISA鉴定重组BbIFN－γ单克隆抗体的特异性Table 2 The specificity of monoclonal antibodies to BbIFN－γdetected by sandwich－ELISA

3 讨 论

酵母表达系统为外源基因在真核细胞中的表达提供了广阔的前景［11］。与原核表达系统相比，酵母能提供更高级的蛋白折叠途径。当使用酵母分泌信号序列时，酵母能直接分泌正确折叠和处理蛋白，表达出来的真核蛋白更加接近天然的蛋白［12］。不过对于酵母表达，许多A＋T富含区可作为多腺苷酸或转录终止信号，导致仅产生低水平或截断的mRNA［13］，某些稀有密码子也往往成为制约翻译速率的因素。如果基因中存在大量A＋T富含区和稀有密码子密集区时，常需要对基因进行偏向于巴斯德毕赤酵母偏爱密码子和有更高的G＋C含量的方向进行全基因合成［14］。本试验前期进行诱导表达的是原始序列，在鉴定为正确的转化子的前提下，诱导了几次，发现目的蛋白始终未得到表达，考虑到Bb－IFN－γ的成熟肽序列为富含A＋T的基因，且不可避免的含有毕赤酵母稀有密码子，本研究采用了全基因合成，将原始序列改成毕赤酵母偏爱密码子，结果得到高效表达，证明了密码子的偏好性确实对外源蛋白的表达量有很大影响。

本研究采用MDBK－VSV系统分别对大肠埃希菌和毕赤酵母表达的水牛IFN－γ蛋白进行了抗病毒活性比较，发现酵母真核表达产物有很高的抗病毒活性（3.13×106U／mg），高于原核表达产物的活性（7.07×105U／mg），这也与有关报道［15－17］相符合。这很可能是因为原核表达缺乏必要的蛋白折叠修饰和糖基化功能，而酵母经过真核的必要的修饰与加工，表达出来的蛋白更加接近天然IFN－γ的原因。

利用纯化的毕赤酵母表达蛋白免疫小鼠，获得了5株高效价的BbIFN－γ单克隆抗体，建立了检测BbIFN－γ的夹心ELISA，该方法的检测灵敏度达到125pg／mL，灵敏度高且特异性良好。因此，该方法可望进一步用于水牛结核病和其他疫病的诊断，为定量检测水牛IFN－γ试剂盒的研制和水牛结核病的检测和控制奠定了基础。

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