基因Ⅳ型戊型肝炎病毒ORF3对靶细胞脂肪因子表达的影响

杜 丽，成 鹰，史巧芸，焦寒伟，荣 辉，张珈宁，贾晓晓，郭莳雨，朱华培，王凤阳

（1.海南大学农学院，海南海口570228；2.海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室，海南海口570228；3.海口市动物基因工程重点实验室，海南海口570228）

戊型肝炎（Hepatitis E）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）引起的、以黄疸为主的急性病毒性肝炎［1］。在我国发生的急性病毒性肝炎流行中，戊型肝炎约占10%，主要以Ⅰ型HEV和Ⅳ型HEV为主［2－3］。近年来，戊型肝炎作为一种重要的人兽共患病，引起了越来越多学者的关注［4－5］。

HEV基因组全长7.6kb，ORF1、ORF2和ORF3共3个编码框，其中，pORF3与细胞信号调控关系密切［6］。脂肪因子既包括传统意义上的瘦素、脂联素、抵抗素、内脂素，也包括与炎症及免疫相关的细胞因子，如肿瘤坏死因子－A、白细胞介素－6等。这些因子的生成与功能失调与肝脏炎症、纤维化和免疫系统紊乱密切相关［7－11］。为了探讨 HEV ORF3影响靶细胞脂肪因子表达的分子机制，应用蛋白芯片技术分析稳定表达ORF3的HEK293细胞显著上调／下调的脂肪因子的表达。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 稳定表达genotypeⅣHEV的pEGFP－ORF3的HEK293细胞和稳定表达pEGFP的HEK293细胞由本实验室构建［6］并保存备用。

1.1.2 蛋白芯片 Human Adipokine Antibody Array Kit为RayBiotech公司产品，该芯片包括62种人脂肪因子的抗体，以及确保试验成立的阴性和阳性对照（图1）。

1.2 方法

1.2.1 细胞总蛋白提取 稳定表达genotypeⅣHEV的pEGFP－ORF3的HEK293细胞，稳定表达pEGFP的HEK293细胞总蛋白提取参照文献［6］进行。

1.2.2 蛋白芯片分析 蛋白芯片分析参照说明书进行：①封闭与孵育。将点有抗体的膜浸入2mL封闭液中，室温孵育30min后，将膜与1mL总蛋白样本在室温条件下在密封袋中孵育1h～2h。取出膜后，用洗膜缓冲液洗3次，每次5min。加入生物素标记的抗体，室温条件下在密封袋中孵育1h～2h。取出膜后，用洗膜缓冲液洗3次，每次5min。加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，室温条件下在密封袋中孵育2h。取出膜后，用洗膜缓冲液洗3次，每次5min。②检测。加入250μL检测液，室温条件下孵育2min后，用X光片检测信号。

2 结果

将来自稳定表达pEGFP的HEK293细胞的蛋白样本，来自稳定表达pEGFP－ORF3的 HEK293细胞的蛋白样本，和来自HEK293细胞的DMEM培养液上清的蛋白样本，分别与芯片1，芯片2和芯片3杂交。蛋白芯片杂交结果显示，在1a、1b、2a、2b、14i、14j的6个点，3张膜阳性对照 （POS）的信号均成立，在3a、3b、4a、4b的4个点，3张膜阴性 对照 （NEG）均成立 （图2）。

图1 人脂肪因子抗体芯片Fig.1 Human adipokine antibody array

图2 两种细胞系人脂肪因子表达的差异Fig.2 The relative adipokine expression of two stable cell line

1c和1d两个点的信号表明，稳定表达pEGFPORF3的HEK293细胞的Fas表达水平高于稳定表达pEGFP的HEK293细胞和HEK293细胞的Fas表达水平；7i和7j两个点的信号表明，稳定表达pEGFP－ORF3的HEK293细胞的TIMP－2表达水平高于稳定表达pEGFP的HEK293细胞和HEK293细胞的TIMP－2表达水平；6a和6b两个点的信号表明，稳定表达pEGFP－ORF3的HEK293细胞的ACE－2表达水平低于稳定表达pEGFP的HEK293细胞的ACE－2表达水平（图2）。

3 讨论

pORF3是HEV的重要病毒蛋白，与细胞信号调控关系密切。脂肪因子的生成与功能失调与肝脏炎症、纤维化和免疫系统紊乱密切相关。探讨pORF3的表达对于脂肪因子表达的影响可以为揭示HEV的致病机制提供重要线索。

传统的脂肪因子表达检测手段是ELISA。本试验中所应用的蛋白芯片技术可以同时对62种人脂肪因子的表达进行检测，极大地提高了检测效率及检测的准确性。

Fas（也称APO－1或CD95）属于肿瘤坏死因子受体（TNF－R）家族，包括1个细胞内“死亡功能域”，能够导致凋亡的发生［12］。在稳定表达EGFPORF3的HEK293细胞，发现Fas的表达水平升高，这一结果预示着pORF3在靶细胞的表达可能与凋亡发生相关。同时，我们还发现，在稳定表达EGFP－ORF3的HEK293细胞，金属蛋白酶组织抑制剂－2 （tissue inhibitors of metalloproteinases 2，TIMP－2）的表达升高。根据文献报道，在慢性肝病和肝纤维化的动物模型，均观察到了TIMP－2表达升高［13］。说明pORF3的过表达可能和肝纤维化具有密切联系。

血管紧张素转化酶抑制剂2（angiotensin－converting enzyme 2，ACE2）通过剪切Ang－Ⅱ，生成Ang－（1－7），抑制能促进炎症因子、生长因子以及促纤维化因子释放的Ang－Ⅱ信号途径［14］。本研究发现，与稳定表达pEGFP的HEK293细胞相比，稳定表达pEGFP－ORF3的HEK293细胞的ACE－2表达水平降低，说明pORF3的表达可能通过降低ACE－2表达水平，解除对于炎症因子、生长因子以及促纤维化因子释放的作用。

［1］ Reyes G R ，Purdy M A ，Kim J P，et al.Isolation of a cDNAf rom the virus responsible for enterically transmitted non－A，non－B hepatitis［J］.Science，1990，247：1335－1339.

［2］ Ahmad I，Holla R P，Jameel S.Molecular virology of hepatitis E virus［J］.Virus Res，2011，1：47－58.

［3］ Wang H，He Y，Shen Q，et al.Complete genome sequence of the genotype 4hepatitis E virus strain prevalent in swine in Jiangsu Province，China，reveals a close relationship with that from the human population in this area［J］.J Virol，2012，15：8334－8335.

［4］ Dong C，Zafrullah M，Mixson－Hayden T，et al.Suppression of interferon－αsignaling by hepatitis E virus［J］.Hepatology，2012，55，1324－1332.

［5］ Suneetha P V，Pischke S，Schlaphoff V，et al.Hepatitis E virus（HEV）－specific T－cell responses are associated with control of HEV infection［J］.Hepatology，2012，55：695－708.

［6］ Liu T，Lei M，Jiao H，et al.RNA interference induces effective inhibition of mRNA accumulation and protein expression of SHEV ORF3gene in vitro［J］.Curr Microbiol，2011，62：1355－1362.

［7］ 祝 烨.脂肪因子研究进展［J］.生物医学工程学杂志，2010，27（2）：476－480.

［8］ 竹井谦之，姚月歌.脂肪因子同肝脏的相关性［J］.日本医学介绍，2007，28（4）：152－154.

［9］ Aksu H S，Kurtaran B，Onlen Y，et al.Association of insulin resistance，viral load，and adipokine levels with liver histology in patients with chronic hepatitis C：an observational，multicenter study in Turkey ［J］.Eur J Gastroenterol Hepatol，2012，24（12）：1393－1399.

［10］ Fitzpatrick E，Dew T K，Quaglia A，et al.Analysis of adipokine concentrations in paediatric non－alcoholic fatty liver disease［J］.Pediatr Obes，2012，7（6）：471－479.

［11］ Nobili V，Carpino G，Alisi A，et al.Hepatic progenitor cells activation，fibrosis，and adipokines production in pediatric nonalcoholic fatty liver disease［J］.Hepatology，2012，56（6）：2142－2153.

［12］ Strasser A，Jost P J，Nagata S.The many roles of FAS receptor signaling in the immune system［J］.Immunity，2009，30（2）：180－192.

［13］ Arthur M J.FibrogenesisⅡ.Metalloproteinases and their inhibitors in liver fibrosis ［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2000，279（2）：G245－249.

［14］ Bindom S M，Lazartigues E.The sweeter side of ACE2：physiological evidence for a role in diabetes［J］.Mol Cell Endocrinol，2009，302（2）：193－202.