嗜水气单胞菌Ⅲ型分泌系统AscV基因的检测与序列分析

陈翠珍，葛慕湘，靳晓敏，张艳英，史秋梅，房 海

（河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室，河北秦皇岛066004）

嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）是多种鱼类、两栖类、爬行类等动物的重要病原菌，常给水产养殖业造成严重的经济损失［1－2］。另外，也可引起多种陆生动物（猪、鸡、长颈鹿、水貂、貉、狐、家兔、大熊猫、鸭等）感染发病［3－5］，并可导致人的胃肠道感染、食物中毒、败血症、脑膜炎、肺炎等［6－9］。因此，该菌被列入了人兽共患病的病原菌范畴，是一种典型的人－兽－鱼共患病原菌，已在预防医学、预防兽医学、鱼类病害学、公共卫生学领域日益被广泛关注。

正是由于嗜水气单胞菌作为病原菌在人及动物（尤其是水产养殖动物）感染病例中的频繁出现，也使得对该菌的毒力因子及致病机制研究逐渐增多，并已初步研究明确了一些相关的毒力因子，如气溶素、溶血素、黏附素、外膜蛋白等［2，10－11］。

细菌分泌系统是近年来对病原菌致病机制研究的重要内容之一，特别是Ⅲ型分泌系统（typeⅢsecretion system，TTSS），因其与革兰阴性病原菌的毒力因子分泌有关，已引起人们的高度重视。本研究对分离于草鱼、青鱼、鲤鱼、牙鲆、宽体金线蛭、中国林蛙等水产养殖动物的42株致病性嗜水气单胞菌Ⅲ型分泌系统AscV基因进行了检测，并分析了代表菌株的相关毒力基因序列，以期为有效防治由嗜水气单胞菌引起的感染及其对该菌致病机制的研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 由河北科技师范学院、河北省预防兽医学重点实验室分离、鉴定保存，具体来源、株数、编号、代表菌株及GenBank登录号见表1。

1.1.2 DNA提取试剂盒及引物 DNA提取试剂盒为北京赛百盛基因技术有限公司产品；基因扩增引物参照文献［12］，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，上引物5′－CTA GGA TCC ATG GAC GGC GCC ATG AAG TT－3′；下引物5′－AGT GTC GAC TAT TCG CCT TCA CCC ATC CC－3′。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养和DNA模板的制备 取42株保存菌种分别接种于LB平板28℃培养24h，各挑取1个菌落，接种于LB肉汤中，28℃、110r／min振荡培养16h；然后按1.1.2中DNA提取试剂盒说明所述方法，提取DNA作为PCR模板DNA。

1.2.2 Ⅲ型分泌系统基因的检测 PCR反应体系为25μL：2×TaqMasterMix 12.5μL，上下引物各0.5μL，去离子水9.5μL，DNA模板2μL。反应条件为：94℃5min，94℃30s，退火温度分离自宽体金线蛭、林蛙、草鱼、青鱼、鲤鱼的菌株采用54℃，分离自牙鲆的采用55℃，时间均为50s，72℃1.5 min，共35个循环；最后72℃10min。用10g／L琼脂糖凝胶电泳检测结果。

对于没有出现预期条带的测试菌株，以58℃为中心温度，±5℃为幅度再做梯度PCR，再次无预期条带出现者视为无所检测基因。

表1 试验菌株来源与编号Table 1 The origin and number of tested strains

1.2.3 毒力基因序列分析 根据琼脂糖凝胶电泳检测结果，取各毒力基因中条带最清晰的菌株作为代表菌株，对其PCR产物由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，具体代表菌株为分离于宽体金线蛭的HTQ010505－9、中国林蛙的HQ070610B－1、牙鲆的 HC010916B－1草鱼的 HL060811－1及青鱼的HL060811－4。采用Clustalx1.81软件进行序列同源性分析，用DNA Star软件构建系统进化树。

2 结 果

2.1 TTSS的AscV基因的携带率

分别以分离自不同水产养殖动物的42株嗜水气单胞菌DNA为模板，经PCR扩增，除分离于宽体金线蛭的 HTQ010505－1、HTQ010505－2、中国林蛙的 HQ070610A－2、牙鲆的 HQ070610B－9、草鱼的HC960715－1、HC960715－3、HC960715－4、HC960715－5以外，其他菌株均扩增出大小约710bp的特异性条带，与预期产物大小相符，其中分离于鲤鱼的嗜水气单胞菌条带模糊，代表菌株条带见图1。表明分离于宽体金线蛭嗜水气单胞菌对Ⅲ型分泌系统AscV基因的携带率为80%（8／10）、中国林蛙的携带率为90.9%（10／11）、牙鲆的携带率为90%（9／10）、草鱼的携带率为42.9%（3／7）、青鱼和鲤鱼的携带率为100%（2／2）。

2.2 Ⅲ型分泌系统基因的同源性

取GenBank库中已报道的且与测序菌株TTSS的AscV基因同源性较高的7株菌作为参考菌株，与5株供试代表菌株的进行比对（图2）。

由图2可见，所测5株嗜水气单胞菌Ⅲ型分泌系统的AscV基因与参考菌株的同源性在81.0%～98.7%之间；各测序代表菌与杀鲑气单胞菌（AJ616218.2）、维氏气单胞菌（EF215451.1）参考菌株的同源性较高，在91.2%～98.7%之间；供试不同来源菌株之间Ⅲ型分泌系统基因的同源性较高，在91.2%～99.3%之间。

图1 测序菌株TTSS的AscV基因PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results of AscV of representative strains

将5株测序代表菌株Ⅲ型分泌系统的AscV基因与GenBank中选取的7株参考菌株，采用DNA Star软件构建遗传发育系统进化树（图3）。结果显示，供试菌株中来源于草鱼的HL060811－1、来源于中国林蛙的 HQ070610B－1、来源于宽体金线蛭的HTQ010505－9菌株与维氏气单胞菌（EF215451.1）、杀鲑气单胞菌（AJ616218.2）菌株聚为一个分支；来源于牙鲆的 HC010916B－1和来源于青鱼的HL060811－4菌株处于同一分支，并与气单胞菌属FJ573181.1、嗜水气单胞菌DQ188833.1菌株聚为一个分支；其余的温和气单胞菌（AJ749609.1）、嗜水气单胞菌（AY763611.1、AY394563.2）菌株各自形成一个分支。

图2 代表菌株与基因库中参考菌株TTSS的AscV基因序列对比Fig.2 The comparison of AscV gene sequences between representative strains and reference strains

图3 代表菌株与参考菌株TTSS的AscV基因进化树Fig.3 Phylogenetic tree based on AscV gene sequences of representative strains and reference strains

3 讨论

据相关资料记载，革兰阴性菌的分泌系统有6种类型，它们以特有的方式不同程度地参与细菌的致病过程［13］。其中，Ⅲ型是一个独立的分泌系统，通常由30kb～40kb大小的基因编码，以毒力岛（pathogenicity island）的形式存在于多种病原菌的染色体或质粒上，如耶尔森菌（Yersinia）、铜绿假单胞 菌 （Pseudomonas aeruginosa）、大 肠 埃 希 菌（Escherichia coli）、沙门菌（Salmonella）、福氏志贺菌（Shigella flexneri）、欧文菌（Erwinia）、根瘤菌（Rhizobium）等［14，1－2］。近年来，国内外对嗜水气单胞菌Ⅲ型分泌系统的研究已有相关报道，如Silvia等2009年曾报道从嗜水气单胞菌AH－3中发现两个效应蛋白（AexT，AexU），从同属的杀鲑气单胞菌发现了4个效应蛋白（AexT，AopP，AopH，AopO）［2］。Yu H B等［15］2004年首次报道了嗜水气单胞菌AH－1株中存在TTSS，利用基因步移法克隆了全长的TTSS基因序列，其中包括5个启动子，25个开放阅读框表达25种TTSS组分蛋白；随后应用一对保守引物检测了分离自人类、牛奶、鱼类、蛇、蛙的33株嗜水气单胞菌的TTSS基因 ，结果发现所检33株菌，无论是致病性菌株还是非致病性菌株均能扩增出相应条带，且33条序列同源性很高。本试验共检测了分离自宽体金线蛭、中国林蛙、牙鲆、草鱼、青鱼、鲤鱼等水产养殖动物的42株致病性嗜水气单胞菌，发现其中80.95%（34／42）的菌株携带TTSS的ascV基因，且与参考菌株TTSS的ascV基因具有较高的同源性，该结果进一步表明了TTSS基因在嗜水气单胞菌中存在的普遍性。

研究发现，TTSS基因不仅存在于嗜水气单胞菌中，也存在于同属的杀鲑气单胞（A.salmonicida）、豚鼠气单胞菌（A.sobria）和维氏气单胞菌（A.aeronii）［16］。本研究结果表明，供试的不同来源代表菌株TTSS的ascV基因与杀鲑气单胞菌（AJ616218.2）、维氏气单胞菌（EF215451.1）参考菌株TTSS的ascV基因具有较高的同源性（91.2%～98.7%），与温和气单胞菌同源性在86.2%～89.9%之间。说明TTSS在气单胞菌属细菌中存在亦较广泛。

众多研究资料表明，Ⅲ型分泌系统与病原菌的毒力因子分泌有关。它是一个由多组分蛋白复合体形成的跨膜通道，通过分泌蛋白或把毒力蛋白直接注入宿主细胞发挥其致病作用。Carvalho－Castro G A等［16］检测嗜水气单胞菌分离株中TTSS相关基因ascV和aopB，结果表明ascV＋／aopB＋在死亡率高的发病鱼体内分布率高，初步认为TTSS的存在很可能增加嗜水气单胞菌的毒力。Vilches S等［17］研究发现，TTSS基因ascV缺失株较野生株的毒力均减弱。本研究供试的42株嗜水气单胞菌，分离自以败血症感染为特征的不同水产养殖动物，并通过人工感染试验表明均为致病性菌株［18－19］。本次所测为Ⅲ型分泌系统中的ascV基因，除分离于草鱼的菌株外（7株），其余35株该基因的携带率均在80%以上，这一结果与文献［16－17］的报道一致，进一步说明该基因的存在与其致病性有密切关联。

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