瘦素预处理对2型糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

余 帆，徐彤彤，吕祥威，佐 妍，李 静

（1.桂林医学院附属医院特需病区，广西 桂林 541001；2.桂林医学院附属医院急诊科，广西 桂林 541001）

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器 实验动物：清洁级SPF雄性SD成年健康大鼠60只，8周龄，体质量170～190g，由桂林医学院动物实验中心提供，许可证号：SCXK桂2013-0001。动物饲养条件：室温18～25℃，相对湿度50%～80%的环境下，每天日照时间为8：00～20：00。主要试剂和仪器：链脲佐菌素（streptozotocin，STZ，购自美国Sigma公司），重组瘦素（Liptin，购自美国R＆D Systems公司），丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测试盒，肿瘤坏死因子α（tumor necrosisfactor-alpha，TNF-α）ELISA 试剂盒（南京建成生物工程研究所），125I-胰岛素放射免疫分析药盒（北京市福瑞生物工程公司）。主要仪器：血糖仪（罗氏，卓越型）、小型动物呼吸机、Leica显微镜、超声匀浆机、高速离心机和电子秤。

1.2 饲 料 普通饲料由本校实验动物中心提供。高糖高脂饲料配方为每100g饲料中含标准粉17.5g、大 豆 粉 10.0g、麸 皮 7.0g、玉 米 粉12.0g、鱼粉2.5g、食盐0.5g、酵母粉0.5g、猪油 15.0g、蔗 糖 10.0g、奶 粉 5.0g、麻 油5.0g、鸡蛋10.0g和花生5.0g。将上述配料充分混匀，烤熟后，压制成形后喂养大鼠，饲料于喂养前1周临时配制。

1.3 分组方法 将60只大鼠随机分为正常对照组（n＝10，普通饲料喂养4周）和糖尿病（DM）组（n＝50，采用高糖高脂喂养4周后，禁食12h腹腔注射链脲佐菌素35mg·kg－1，以0.1mol·L－1柠檬酸缓冲液溶解，注射药物72h后大鼠尾静脉采血测定血糖，以随机血糖大于16.7mmol·L－1且持续1周大鼠为造模成功的DM大鼠）。取造模成功大鼠40只再随机分为假手术组（DM sham operation）、心肌梗死组（DM-MIRI）、心肌梗死瘦素预处理组（DM-leptin＋MIRI）和心肌梗死术后瘦素处理组（DM-MIRI＋leptin），每组各10只，DM-leptin＋MIRI组大鼠在MIRI手术前30min给予腹 腔 注 射 重 组 瘦 素，剂 量 为50μg·kg－1[6]；DM-MIRI＋leptin组大鼠于 MIRI手术后30min给予腹腔注射重组瘦素，剂量为50μg·kg－1。

1.4 大鼠心肌梗死模型的制备 采用结扎大鼠冠状动脉左前降支，水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，切开颈部正中皮肤，钝性分离肌肉至气管。气管插管接小型动物呼吸机（呼吸频率为72次·min－1）。颈部各组织逐层缝合。大鼠冠状左前降支开胸结扎：在胸骨左侧2～3mm处切开皮肤，皮下钝性分离，暴露心脏，钝性分离第二肋间隙肋间肌。小心暴露心脏，剪开心包膜，用生理盐水沾湿的棉签轻压心脏。以无创小圆针进针（5-0丝线）在左心耳下缘内侧1～2mm处，深度约为1mm，经由肺动脉圆锥右上方出针，留线垫置硅胶管。心肌梗死模型成功判定标准：直视下可见被结扎血管供应区心肌变为苍白色或肿胀。缺血30min后松开线结。

1.5 各项标本制备 大鼠腹腔静脉取血5mL，抗凝，摇匀，4℃、1 000r·min－1低温离心8min，分离血清置于－70℃冰箱保存待测。大鼠左室心底部取心肌，50mg心肌放入0.5mL生理盐水中，用超声匀浆机液氮低温状态下制备心肌匀浆。取大鼠左室前壁肌组织，石蜡包埋、切片、HE染色，显微镜下观察各组大鼠心肌细胞形态学。

1.6 实验参数的测定 采用静脉葡萄糖氧化酶法测定大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）水平；采用放射免疫法测定大鼠血清胰岛素（fasting insulin，FINS）和瘦素水平；采用酶联免疫分析（ELISA）法测定大鼠血清TNF－α水平；采用HPLC法测定大鼠MDA和SOD活性。胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）＝FBG×FINS/22.5。

1.7 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件分析处理实验数据。各组大鼠FBG、FINS、TNF-α、SOD、MDA、瘦素水平和HOMA-IR均以±s表

示，组间数据比较采用t检验或单因素方差分析。

2 结 果

2.1 各组大鼠FBG、FINS水平和 HOMA-IR

与正常对照组比较，造模成功T2DM 4组大鼠的FBG、FINS水平和HOMA-IR均明显升高（P＜0.01）； 与 假 手 术 组 比 较，DM-MIRI 组、DM-leptin＋MIRI组和 DM-MIRI＋leptin组大鼠FBG、FINS水平和 HOMA-IR升高（P＜0.01）；与DM-MIRI组比较，DM-leptin＋MIRI组大鼠FBG、FINS水平和 HOMA-IR明显降低（P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠FBG、FINS水平和HOMA-IRTab.1 Levels of FBG，FINS，and HOMA-IR of rats in various groups （n＝10，±s）

表1 各组大鼠FBG、FINS水平和HOMA-IRTab.1 Levels of FBG，FINS，and HOMA-IR of rats in various groups （n＝10，±s）

＊ P＜0.01compared with normal control group；△P＜0.01compared with DM sham opreation group；＃P＜0.01compared with DMMIRI group.

Group FBG[cB/（mmol·L－1）]FINS[λB/（mIU·L－1）]31 DM sham operation 18.70±8.48＊ 26.77±1.64＊ 5.68±0.75＊DM-MIRI 28.50±7.14＊△ 28.96±1.71＊△ 6.76±0.47＊△DM-leptin＋MIRI 20.80±6.73＊△＃ 20.36±1.83＊△＃ 3.89±0.61＊△＃DM-MIRI＋leptin 27.50±5.42＊△ 26.29±1.77＊△ 6.12±0.24＊HOMA-IR Normal control 4.86±0.35 13.44±6.52 2.19±0.△

2.2 各组大鼠血清瘦素、TNF-α、SOD和 MDA水平 与正常对照组比较，造模成功的T2DM大鼠的瘦素、TNF-α和 MDA水平均升高，SOD活性降低（P＜0.01）；与假手术组比较，DM-MIRI组、DM-leptin＋MIRI组和 DM-MIRI＋leptin组大鼠瘦素、TNF-α和 MDA水平升高，SOD活性降低（P＜0.01）；与 DM-MIRI组比较，DM-leptin＋MIRI组大鼠瘦素、TNF-α和 MDA水平

明显 降 低，SOD 活 性升高（P＜0.01）；而DM-MIRI＋leptin组大鼠瘦素、TNF-α和MDA水平反而略高，但差异无统计学意义。见表2。

2.3 各组大鼠心肌组织病理形态学 与正常对照组比较，假手术组大鼠心肌细胞肥大、变形，出现心肌纤维排列紊乱，局部坏死，有中性粒细胞聚集现象；DM-MIRI组大鼠出现心肌纤维排列紊乱，呈不规则分布，细胞结构依稀可见，心肌呈片状局灶性坏死，有出血，并有大量炎症中性粒细胞聚集；DM-Leptin＋MIRI组大鼠虽仍有心肌细胞肥大、心肌组织结构紊乱，但出血坏死灶与中性粒细胞聚集明显减少，病变明显改善；而DM-MIRI＋Leptin组大鼠心肌组织病变亦有相同改善，但程度不及DM-Leptin＋MIRI组。见图1（插页五）。

表2 各组大鼠血清瘦素、TNF-α、MDA水平和SOD活性Tab.2 Levels of leptin，TNF-α，MDA，and activities of SOD of rats in various groups （n＝10，±s）

表2 各组大鼠血清瘦素、TNF-α、MDA水平和SOD活性Tab.2 Levels of leptin，TNF-α，MDA，and activities of SOD of rats in various groups （n＝10，±s）

＊ P＜0.01compared with normal control group；△ P＜0.01compared with DM sham operation group；＃ P＜0.01compared with DM-MIRI group.

Group Leptin[ρB/（μg·L－1）]TNF-α[ρB/（μg·L－1）]SOD[λB/（U·mg－1）]MDA（nmol·mg－1）47.1±5.1 DM sham operation 5.07±0.20＊ 6.01±1.72＊ 15.4±7.6＊ 66.3±6.5＊DM-MIRI 30.01±2.12＊△ 79.34±13.22＊△ 5.1±1.2＊△ 189.1±23.9＊△DM-leptin＋MIRI 16.04±1.97＊△＃ 33.05±7.16＊△＃ 23.7±2.9＊△＃ 76.1±14.9＊△＃DM-MIRI＋leptin 32.21±1.98＊△ 84.13±8.33＊△ 16.6±3.1＊△ 201.1±25.3＊Normal control 3.01±0.12 3.13±1.06 34.1±8.1△

3 讨 论

瘦素是作为一种由脂肪组织分泌的神经肽类物质，在能量平衡、脂类代谢和胰岛素分泌等机制中发挥着重要作用[7]。而高水平瘦素可使血管痉挛，还通过诱导与增加活性氧而上调核因子－κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB） 与 活 性 蛋 白（AP-1）活性，加剧局部炎症反应，从而进一步加重心肌损伤[8]。人体体内存在的 “脂肪－胰岛素”内分泌轴，其是一个双向调节反馈通路，瘦素可通过这个内分泌轴维持系统平衡[9]。

MIRI的发生机制较为复杂，其主要与再灌注后大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生、炎症介质浸润和细胞内钙超载等有关。炎症与氧化应激状态均可影响机体胰岛素传导系统中蛋白质磷酸化的过程，进一步加重IR[3－4]。IR可引起细胞糖脂代谢失衡，致使血管内皮功能紊乱，进一步介导血栓形成、血管舒张功能障碍、氧化应激增强等，严重危害血管的结构与功能，导致心血管紊乱的恶性循环，即IR的形成与血管内皮功能紊乱的产生是相伴发生，两者的进程既相互平行又相互促进[10]。

炎症在糖尿病的发病机制中发挥媒介与预测作用。TNF-α是体内炎症反应和一系列病理生理过程的重要递质，通过抑制葡萄糖转运因子－4（GLUT-4）mRNA的表达，以削弱其与胰岛素受体的亲和力，可能作为重要环节参与到IR发病机制中[11]。同时，TNF-α还可促使中性粒细胞在缺血心肌组织的聚集，并释放活性氧和蛋白水解酶等物质，损伤心肌组织[12]。而大量中性粒细胞聚集，可堵塞毛细血管、促使大量促炎因子和氧自由基的释放，导致血管通透性的改变引发水肿进而加重损伤。血清TNF-α水平是反映心肌缺血再灌注炎症损伤严重程度的参考指标。本研究结果显示：与正常对照组比较，其他4组T2DM大鼠瘦素、TNF-α、FINS水平与HOMA-IR均升高。与假手术组比较，DM-MIRI组大鼠的瘦素、TNF-α、FINS水平与HOMA-IR显著升高；而心肌梗死瘦素预处理组大鼠血清瘦素、TNF-α、FINS水平与HOMA-IR则显著降低；心肌梗死术后瘦素处理组的血清瘦素、TNF-α、FINS水平与 HOMA-IR反而略高。提示T2DM大鼠心肌缺血再灌注时，瘦素预处理可降低TNF－α、FINS水平与HOMA-IR值，瘦素预处理发挥保护作用是可能通过下调机体内实际瘦素水平，减少炎症因子的聚集与浸润，并可能参与改善由TNF-α介导的IR抵抗这一机制中来实现。而缺血后瘦素处理不仅不能改善T2DM大鼠MIRI时TNF－α及IR水平，反而更进一步加重损伤心肌。

高糖可诱导细胞内氧自由基的生成，过多的氧自由基通过影响胰岛素传导系统中蛋白质磷酸化的过程而降低胰岛素的敏感性，加重IR[4]。氧自由基介导的氧化损伤将导致T2DM及其并发症的发生发展，T2DM大鼠在氧化应激状态下，能诱导细胞线粒体膜通道开放，而使得细胞质中的水和小分子物质散入线粒体中，释放凋亡相关因子，启动瀑布式凋亡反应[13]。本研究另一检测因子 MDA是细胞内最重要的脂质过氧化代谢产物，MDA在血清中的水平变化能直接反映心肌细胞脂质过氧化程度，且间接反映氧自由基活性[14]。SOD作为心肌内天然存在的抗氧化酶，能够反应机体清除氧自由基能力大小[15]，故血清MDA水平可与SOD活性作为判断MIRI中由氧自由基引起损伤的参考指标。本研究结果显示：与正常对照组比较，其他4组T2DM大鼠MDA和瘦素水平均升高，SOD活性降低。与假手术组相比较，DM-MIRI组大鼠的MDA、瘦素水平明显升高，SOD活性明显降低；而心肌硬死瘦素预处理组血清MDA和瘦素活性则显著降低，SOD活性显著升高；心肌梗死术后瘦素处理组大鼠血清MDA、瘦素水平反而略升高，表明瘦素预处理可通过显著减少氧自由基产生和增强SOD活性，并可能通过下调机体内实际瘦素水平，发挥 “脂肪－胰岛素轴”作用来改善由氧化应激状态所介导的IR状态来减轻缺血再灌注对T2DM的心肌损伤。

本研究结果显示：对于T2DM大鼠MIRI前给予一定浓度的瘦素干预可达到心肌保护作用，且瘦素预处理与缺血后处理比较，效果更明显。其可能机制为：瘦素预处理可下调炎症相关因子水平并改善氧化应激状态，从而缓解IR并减轻由此介导的损伤。通过外源性瘦素预处理而降低内源性瘦素的实际水平，发挥瘦素与胰岛素之间的双向调控作用，进一步改善IR状态，而降低T2DM大鼠心肌缺血再灌注损伤过程中的心肌损害作用。

综上所述，瘦素预处理可通过降低TNF－α、MDA和瘦素水平，且提高SOD活性，从而减轻由炎症、氧化应激及IR所介导的损伤，保护受损心肌。

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