人结肠癌细胞中血管生成拟态与肿瘤细胞迁移和侵袭能力的关系

刘见荣，管 宇，可 飞，李 文，罗梅宏，侯风刚

（1.上海中医药大学附属市中医医院肿瘤科，上海 200071；2.上海中医药大学附属市中医医院实验室，上海 200071；3.东南大学医学院病理与病理生理学系，江苏 南京 210009）

结肠癌是发生于结肠部位的常见的消化道恶性肿瘤，其发病率占胃肠道肿瘤的第3位[1]，且呈逐年上升趋势。虽然近十年来结肠癌的诊断和治疗水平已有了较大的提高，但是由于结肠癌的转移性强、预后差，结肠癌的死亡率仍然很高，因此研究结肠癌与转移有关的机理是寻找结肠癌有效治疗方法的一个新的切入点。血管生成拟态（vasculogenic mimicry，VM）是近年来发现的一种全新的肿瘤血液供应模式。高侵袭性肿瘤细胞为了满足自身的血供，通过自身变形和细胞外基质（extracelluar matrix，ECM）重塑而形成一种类似血管样的通道[2]。迄今为止，在大多数恶性肿瘤中均发现了VM的存在，并且临床研究[3]表明：VM的存在与肿瘤的发生、发展、转移和不良预后均有密切的关系。VM和转移作为影响预后的两大因素，逐渐引起了人们的关注。有研究[4]显示：存在VM的乳腺癌患者血道转移（肝、肺和骨）的发生率较高，但与淋巴结转移不存在相关性；Lin等[5]研究喉鳞状细胞癌时发现：VM的存在和淋巴结转移也密切相关。越来越多的研究表明：在多种恶性肿瘤中，VM的存在和转移均有一定的相关性。Liu等[3]发现：存在VM的结肠癌患者转移率为61.5%，高于无 VM 存在的阴性对照组（32.3%）。本研究采用体外三维培养方法观察VM在结肠癌细胞中的形成情况，探讨其对肿瘤转移潜能（迁移、侵袭能力）的影响，为结肠癌的治疗提供新的靶向性。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器 HCT8、HCT116、LS174T和HT29 4种人结肠癌细胞由上海中医药大学附属普陀医院实验中心提供；PRMI-1640、McCOY’5A和DMEM高糖培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清（FBS）购自德国PAA公司，鼠尾Ⅰ型胶原购自杭州生友生物技术有限公司，Transwell小室购自美国Costar公司，Matrigel购自美国BD公司；生物安全柜（上海力康科学仪器有限公司），二氧化碳培养箱（美国Thermo公司），倒置显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 细胞培养 HCT8、HCT116、LS174T和HT29细胞常规复苏后，以完全培养液（含10%FBS、100kU·L－1青霉素和100mg·L－1链霉素）培养于37℃、含5%CO2的恒温培养箱中，及时换液、传代，连续培养。HCT8和HCT116细胞采用PRMI-1640培养液，LS174T细胞采用DMEM高糖培养液，HT29细胞采用McCOY’5A培养液。

1.3 细胞三维培养和VM密度的观察 参照Wu等[6]的方法，一定比例的鼠尾Ⅰ型胶原、NaOH（0.1mol·L－1）和培养液等混合液按每孔200μL加入6孔板，室温下放置15min后用于实验。4种结肠癌细胞株在37℃、50mL·L－1CO2条件下用含10%FBS的不同培养基培养（参照细胞培养部分），细胞密度达到80%后，经胰蛋白酶消化后计数，调整细胞密度为8×105mL－1，以每孔1mL分别接种于6孔板中。每天在倒置显微镜下观察4种结肠癌细胞中VM的形成情况，在第6天时行过碘酸雪夫氏染色（periodic acid shiff，PAS）。染色步骤：先用10%甲醛固定5min，过碘酸水溶液氧化10min后，蒸馏水洗涤3次，Schiff氏试剂染20min，自来水冲洗10min，使之显现出红色。倒置显微镜下随机计数5个视野，取VM数目的平均数作为VM密度[7]。

1.4 划痕实验 24孔板中预先铺 Matrigel稀释液，室温静置风干30min。将细胞以合适的密度接种于24孔板中，于恒温培养箱中培养。待培养至形成单层细胞时，用200μL tip头在细胞表面划痕制造伤口，PBS润洗2次，去除刮起的漂浮细胞，用无血清培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养。在0、24h分别于倒置显微镜下观察并拍照记录伤口间的距离。采用IMAGE J软件测定各划痕在对应的时间上的宽度，计算细胞迁移距离。细胞迁移距离＝1/2（0h划痕宽度－24h划痕宽度）。

1.5 侵袭实验 将稀释好的ECM胶按每孔70μL加入预冷的Transwell小室中，于37℃、5%CO2培养箱中继续培养；5h后，采用无血清培养液水化基底膜，室温静置30min；细胞经胰酶消化后，采用无血清培养液调整细胞密度为1×106mL－1，在上室中加入200μL细胞悬液，下室加入600μL含10%FBS的条件培养基，37℃、5%CO2培养箱中继续培养24h；取出Transwell小室，PBS洗2次，10%甲醛固定20min，水洗，0.1%结晶紫染色15min，水洗，用棉签轻轻拭去上层未穿过膜的细胞；显微镜下随即选取5个视野观察细胞并拍照，计数细胞数，结果以细胞数表示[8]。

1.6 统计学分析 采用SPSS 15.0统计软件对数据进行统计学分析。VM密度、迁移距离和穿膜细胞数以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法；VM密度与迁移距离、穿膜细胞数之间关系的分析采用直线相关分析。

2 结 果

2.1 结肠癌细胞形成VM能力 在不同的结肠癌细胞中，VM的形成能力不一样。HCT8和HCT116细胞可以形成明显的VM结构，为VM（＋）组；而在LS174T和HT29细胞中均未见VM的存在，为VM（－）组。HCT8、HCT116细胞中可见到由ECM形成的相互连接成环的图案样网络，LS174T、HT29细胞中无类似结构存在。HCT8和HCT116细胞中VM密度分别为（6.75±0.957）和（5.75 ± 0.957） 个/视 野；LS174T和HT29细胞不能形成VM。与VM（－）组的LS174T和HT29细胞比较，VM（＋）组的HCT8和HCT116细胞VM密度明显升高（P＜0.01）；但是VM（＋）组内HCT8与HCT116细胞进行比较，VM密度差异无统计学意义（P＞0.05），VM（－）组内LS174T与 HT29细胞比较，VM密度差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1（插页五）。

2.2 VM与肿瘤细胞的迁移能力 划痕实验，VM（＋）组迁移能力明显高于VM（－）组，见图2。IMAGE J软件分析，VM（＋）组 HCT8和HCT116细 胞 迁 移 距 离 分 别 为（3.833±0.831）cm和（3.967±0.975）cm；VM（－）组LS174T细胞迁移距离为（0.817±0.333）cm，HT29无迁移趋势。与VM（－）组的LS174T细胞比较，VM（＋）组HCT8和HCT116细胞迁移距离明显增加（P＜0.05）；与 VM（－）组HT29细胞比较，VM（＋）组HCT8和HCT116细胞迁移距离增加更加明显（P＜0.01）；但是VM（＋）组内HCT8和HCT116细胞之间迁移距离比较差异无统计学意义（P＞0.05），VM（－）组内LS174T和HT29细胞之间比较差异亦无统计学意义（P＞0.05）。直线相关分析，VM密度和迁移距离呈正相关关系（r＝0.934，P＜0.05）。

2.3 VM与肿瘤细胞的侵袭能力 Transwell侵袭实验，VM（＋）组的侵袭能力明显强于VM（－）组，见图3（插页五）。Transwell小室法测得VM（＋）组HCT8和HCT116细胞高倍视野内的穿膜细胞数为（71.6±4.506）和（22.4±1.517）个，多于VM（－）组LS174T [（0.6±0.894） 个]和 HT29 [（0.2±0.447） 个]，VM（＋）组与VM（－）组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。VM（＋）组 内 HCT8 和HCT116细胞之间穿膜细胞数差异有统计学意义（P＜0.05），VM（－）组内LS174T和 HT29细胞之间差异无统计学意义（P＞0.05）。直线相关分析，VM密度与穿膜细胞数呈正相关关系（r＝0.853，P＜0.05）。

3 讨 论

VM是肿瘤细胞通过自身变形并与细胞外基质相互作用形成的能够运送血液或营养物质的管道样结构，其特点是管道内没有血管内皮细胞衬覆，肿瘤细胞模仿机体血管生成而形成条索状并围成管道，血液则在该管道内流动[7]。研究表明：VM存在于多种高侵袭性恶性肿瘤中，如肝癌[9]、卵巢癌[10]、胃肠道间质瘤[11]、胆囊癌[12－13]、平 滑 肌 肉瘤[14]、睾丸 肿 瘤[15]、胶 质 瘤[16]、前 列 腺 癌[17]和喉鳞状细胞癌[18]中，且与患者的不良预后有密切关联。虽然有关VM在结肠癌中的报道较少，但是近年来有研究结果显示部分结肠癌中亦存在VM。田翀等[7]通过体外三维培养发现：结肠癌细胞株SW480能够形成VM；Liu等[5]在临床病理实验中发现：在203例结肠癌患者中，有39例患者存在VM；随后通过体外三维培养，发现结肠癌细胞HCT116内有VM形成。

图2 划痕实验测定人结肠癌细胞的迁移能力示意图（×100）Fig.2 Schematic diagram of migration capactity of human colon cancer cells detected by wound healing assay（×100）

本研究采用三维培养技术对4种结肠癌细胞进行培养，使细胞在体外也可与ECM相互作用，表现出与体内状态较为接近的生物学特征。三维培养结果表明：在结肠癌细胞中，HCT8和HCT116可以形成明显的VM结构，LS174T和HT29不能形成VM。上述结果与Liu等[5]的研究结果一致，Liu等发现了结肠癌细胞HCT116可以形成VM，HT29不能形成VM结构。但是对于HCT8和LS174T细胞的研究报道却很少见。实体恶性肿瘤需要血液供应才能持续生长和发生血行转移。长期以来，人们一直认为：肿瘤血管生成是其获得血液供应的唯一途径，VM的发现无疑丰富了人们对肿瘤微循环的认识。VM的特殊结构，使肿瘤细胞与血液直接接触，部分肿瘤细胞可脱落下来随血液流动而发生远处转移，所以有VM的患者比无VM患者更易发生转移，预后更差[14]。因此，VM的出现使肿瘤转移方面的研究方向有了新的切入点。越来越多的研究[19]表明：VM的生成使恶性肿瘤更具侵袭性和转移性。在体外实验中，Sun等[20]在研究肝癌细胞时发现：Twist1通过诱导上皮－间质转化（EMT）的发生而促进VM的形成，通过细胞转染实验下调Twist1的表达，可以抑制VM的形成，还可以减弱细胞的迁移力和侵袭力；而上调Twist1的表达，不仅可以促进VM的形成，也可以增强肠癌细胞的迁移和侵袭能力。随后Lin等[5]在研究结肠癌细胞时发现：与肝癌中Twist1作用类似，锌指E－盒结合同源异形盒1（ZEB1）表达上调后，可以促进VM的形成，也可以增强肠癌细胞的迁移和侵袭能力；而ZEB1表达下调后，在抑制VM形成的同时，也减弱了细胞的迁移和侵袭能力。本研究以结肠癌细胞HCT8和HCT116为VM（＋）组，LS174T和 HT29为VM（－）组，同时进行划痕实验和Transwell侵袭实验，观察VM的存在是否与肿瘤细胞迁移能力及侵袭能力存在相关性。本实验结果显示：VM（＋）组HCT8和HCT116的迁移和侵袭能力明显强于VM（－）组的LS174T和HT29。相关性分析进一步说明了结肠癌内VM与肿瘤细胞迁移、侵袭能力密切相关。

综上所述，本实验通过三维培养技术，证实人结肠癌细胞中确实存在VM，且VM的存在和细胞的迁移、侵袭能力存在相关性，结肠癌中VM的形成有利于癌细胞的迁移和侵袭。虽然已有研究者提出某些分子参与了VM的形成，且影响了细胞的迁移、侵袭能力，但是哪类分子在此过程中起作用及其作用机制尚不清楚，上述问题也将是本文作者下一步研究的重点。通过对VM分子机制的深入研究，将会对结肠癌和其他肿瘤的诊断和靶向性治疗提供新的思路和方法。

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