伪人参皂苷GQ对阿霉素致大鼠急性心肌损伤的保护作用

金 鑫，沈卫章，金立方，贾姣源，李小丰，王秀丽，邸 鑫，张红娟，李平亚

（1.吉林大学第二医院肿瘤血液科，吉林 长春 130041；2.吉林大学再生医学科学研究所，吉林 长春 130021）

以阿霉素（doxorubicin，DOX）为代表的蒽环类抗肿瘤药物是一类对实体肿瘤和造血及淋巴组织肿瘤高度有效的化疗药物，但剂量依赖性的心脏毒性是限制其临床应用的主要障碍。蒽环类药物的心脏毒性是不可逆的，在保持其抗肿瘤疗效的同时，能否有效地控制心脏毒性，使其更好地发挥治疗作用，有重要的临床应用价值。使用心脏保护剂是临床上一种减轻和避免蒽环类药物心脏毒性的策略。右丙亚胺（dexrazoxane，DZR）是美国FDA批准的唯一一个DOX心脏毒性保护剂。但右丙亚胺可能降低蒽环类药物的抗肿瘤效果，加重化疗药物引起的骨髓抑制，对动物和人体细胞可能有致突变作用[1]，因此寻找更有效、更安全的心脏保护药物，仍是基础医学和临床医学上迫切需要解决的问题。伪人参皂苷 GQ（pseudo-ginsenoside GQ，PGQ）为20（S）-人参皂苷Rg3经过结构修饰获得的一种新奥克梯隆型皂苷，具有化合物的发明专利[2]。PGQ具有心肌保护和抗心肌缺血作用[3－4]，而PGQ抗DOX心脏毒性的作用尚未见报道。本实验通过构建大鼠DOX心肌损伤模型，观察大鼠一般状态，测定大鼠心功能和血清肌钙蛋白（troponin I，TnI）水平，观察大鼠心肌组织病理学和超微结构改变，探讨PGQ对大鼠DOX心肌损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器 健康雄性Wistar大鼠30只，清洁级，体质量250～300g，由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（吉）2006-0008，分笼适应性喂养1周，饲养在恒温（23±2）℃、湿度0.50～0.60、人工光照明暗各12h的饲养室内，标准饲料和自来水自行取用；DOX（浙江海正药业股份有限公司，批号：110701），PGQ（吉林大学再生医学科学研究所李平亚教授提供，批号：101125），DZR（江苏奥赛康药业有限公司，批号：D110502），TnI试剂盒（贝克曼库尔特商贸中国有限公司，产品编号：YZB/USA 1227-2009），10%甲醛、3%戊二醛、75%乙醇、10%水合氯醛、20%乌拉坦、1%肝素和普鲁卡因均为国产试剂；电子天平、微量天平、BL-410生物机能实验系统、实验动物手术器械、心肌损伤标志物检测仪、超低温冰箱、显微镜和透射电子显微镜。

1.2 动物分组及给药 按照随机数字法原则，将大鼠随机分为6组，每组5只。对照组（Control）：第1～7天大鼠尾静脉注射等体积的生理盐水，第5天股静脉注射等体积的生理盐水；DOX组：第1～7天大鼠尾静脉注射等体积的生理盐水，第5天股静脉注射18mg·kg－1DOX；DOX＋DZR组：第1～4、6～7天大鼠尾静脉注射等体积的生理盐水，第5天自股静脉的静脉留置针注入DZR180mg·kg－1，1%肝素封管，30min后注射18mg·kg－1DOX；DOX＋低、中、高剂量PGQ组 [DOX＋PGQ（L，M，H）]：第1～7天大鼠尾静脉分别注射3、6和12mg·kg－1PGQ，第5天于注射PGQ 后股静脉注射18mg·kg－1DOX。

1.3 检测指标 观察各组大鼠活动、饮食、粪便、脱发和水肿等情况；测定大鼠体质量（body weight，BW）变化，BW总下降值＝注射DOX前BW－处死前BW。实验第8天，称BW后每只大鼠以20%乌拉坦以5mL·kg－1剂量腹腔注射麻醉，仰卧位固定于手术台上，常规剪毛消毒，取大鼠颈部正中切口暴露并分离右颈总动脉，逆行插入心导管，进而送至左心室，同时连接多导生物信号分析系统，采用BL-410生物机能实验系统记录各组大鼠的左心室压力曲线。记录大鼠的心率（heart rate，HR）、 左 心 室 收 缩 压（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左室内压差（left ventricular pressure，LVP）、左心室内压力上升最大速率（＋dp/dtmax）、左心室内压力下降最大速率（－dp/dtmax），绘制压力曲线。采用无菌

纱布吸干大鼠胸腹腔内积液，分离并暴露大鼠腹主动脉，用5mL一次性注射器抽血2～4mL，检测大鼠血清TnI水平。处死后取出大鼠心脏，去除血液，称心脏质量（heart weight，HW），计算心脏质量/体质量（HW/BW）比值，HW/BW＝HW/处死前空腹BW。

1.4 各组大鼠心肌组织病理和超微结构检查 沿各组大鼠心脏长轴取左心室游离壁心室肌，一部分大鼠心肌组织放入10%甲醛固定，制作病理切片，经苏木精－伊红（HE）染色，在高分辨率的光镜下观察各组大鼠左室壁心肌组织病变情况；另一部分心肌组织采用3%戊二醛固定，按常规制作透射电镜切片标本，在透射电镜下观察各组大鼠心肌超微结构的变化。

1.5 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。各组大鼠BW 总下降值、HW/BW、HR、LVSP、LVP、＋dp/dtmax、－dp/dtmax和血清TnI水平以±s表示，组间均数比较采用t检验。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般状态、BW 总下降值和 HW/

BW DOX组大鼠出现精神不振、厌食、活动减少、BW下降和腹泻等现象，一些大鼠眼、口、鼻周可见红色分泌物，后期出现活动减少、毛发脏乱及嗜睡，一般状态差。DOX＋DZR组和DOX＋低、中、高剂量PGQ组较DOX组大鼠一般状态好。与对照组比较，DOX组大鼠BW总下降值明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与DOX组比较，DOX＋DZR组、DOX＋低剂量PGQ组大鼠BW总下降值差异无统计学意义。与DOX组比较，DOX＋中、高剂量PGQ组大鼠BW总下降值明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05），但与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与DOX＋DZR组比较，DOX＋中、高剂量PGQ组大鼠BW总下降值明显减少（P＜0.05）。DOX组大鼠HW/BW比值明显增高，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。与 DOX 组比较，DOX＋DZR组大鼠HW/BW比值明显减小，差异有统计学意义（P＜0.05），DOX＋DZR组大鼠与对照组比较HW/BW 比值差异无统计学意义（P＞0.05）。与DOX组比较，DOX＋中、高剂量PGQ组大鼠HW/BW比值明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），DOX＋中、高剂量PGQ组大鼠与对照组、DOX＋DZR组大鼠HW/BW比值比较差异无统计学意义（P＞0.05）。DOX＋低剂量PGQ组大鼠HW/BW比值与DOX组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠BW总下降值和HW/BWTab.1 Total decline value of BW and HW/BW of rats in various groups （n＝5，±s）

表1 各组大鼠BW总下降值和HW/BWTab.1 Total decline value of BW and HW/BW of rats in various groups （n＝5，±s）

＊ P＜0.05compared with control group；△P＜0.05compared with DOX group；＃P＜0.05compared with DOX＋DZR group.

Group Total decline value of BW（m/g）HW/BW[wB/（mg·g－1）]Control 4.20±5.67 2.8±0.2 DOX 45.00±7.09＊ 3.5±0.4＊DOX＋DZR 49.60±9.77 3.1±0.1△DOX＋PGQ（L） 45.75±8.83 3.3±0.2 DOX＋PGQ（M） 34.00±6.32△＃ 3.0±2.6△DOX＋PGQ（H） 30.50±4.17△＃ 2.8±0.0△

2.2 各组大鼠在体心功能指标 与对照组比较，DOX组大鼠 HR、LVSP和±dp/dtmax明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与DOX组比较，DOX＋DZR组大鼠LVSP、±dp/dtmax明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；DOX＋DZR组大鼠心功能指标与对照组比较差异无统计学意义。与DOX组比较，DOX＋中、高剂量PGQ组大鼠LVSP、±dp/dtmax明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），DOX＋中、高剂量PGQ组大鼠与对照组心功能指标比较差异无统计学意义，且与DOX＋DZR组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠血清TnI水平 与对照组 [（0.030±0.007）μg·L－1]比较，DOX组大鼠血清TnI水平 [（1.180±0.580）μg·L－1]明显升高（P＜0.05）。与DOX组比较，DOX＋DZR组大鼠血清TnI水平 [（0.157±0.211）μg·L－1]明显降低（P＜0.05），与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与DOX组比较，DOX＋中剂量PGQ组大鼠血清TnI水平 [（0.130±0.147）μg·L－1]明显降低（P＜0.05）。DOX＋低、高剂量PGQ组[（0.367±0.110）和（0.340±0.251）μg·L－1]与DOX组比较，大鼠血清TnI水平差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 各组大鼠心肌组织形态学 对照组大鼠心肌细胞排列紧密，细胞和细胞核形态正常（图1A，见插页三）。与对照组比较，DOX组大鼠心肌组织明显松散，可观察到心肌细胞胞浆内出现明显空泡，有深色细胞核聚集于边缘，胞外间隙明显增宽（图1B，见插页三）。DOX＋DZR组（图1C，见插页三）和DOX＋低、中、高剂量PGQ组大鼠心肌组织的形态改变不十分明显，虽然心肌组织也可见空泡变性，但较DOX组大鼠明显减轻，其中以DOX＋中剂量PGQ组大鼠心肌组织病变减轻最为明显（图2，见插页三）。

表2 各组大鼠在体心功能指标Tab.2 Indexes of cardiac function of rats in various groups （n＝5，±s）

表2 各组大鼠在体心功能指标Tab.2 Indexes of cardiac function of rats in various groups （n＝5，±s）

＊ P＜0.05compared with control group；△P＜0.05compared with DOX group.

Group HR（beat·min－1）LVSP（P/mmHg）LVP（P/mmHg）＋dp/dtmax（mmHg·s－1）－dp/dtmax（mmHg·s－1）Control 464±14 165.00±7.76 171.20±1.90 7 805±102 6 270±355 DOX 391±23＊ 74.10±15.70＊ 65.50±16.68＊ 3 345±170＊ 2 559±566＊DOX＋DZR 418±14△ 117.50±24.95△ 84.40±31.81 5 082±381△ 3 765±625△DOX＋PGQ（L） 423±15△ 70.60±14.77 62.40±13.18 3 601±270 2 851±306△DOX＋PGQ（M） 435±20△ 97.90±5.02△ 99.80±11.58△ 4 716±322△ 3 601±186△DOX＋PGQ（H） 395±21 122.40±35.92△ 104.30±29.45△ 4 350±510△ 3 564±436△

2.5 各组大鼠心肌组织超微结构 对照组大鼠心肌细胞膜完整，线粒体膜完整，嵴致密，清晰可见，基质颗粒均匀（图3A）。DOX组大鼠部分心肌细胞膜局部破裂；线粒体分布紊乱、肿胀，外膜破损，嵴减少，排列紊乱，模糊不清，甚至断裂消失，基质减少，线粒体内大片空化（图3B）。DOX＋DZR组大鼠心肌细胞结构不清晰，肌原纤维排列紊乱、稀疏，部分肌原纤维断裂、溶解，形成溶解灶；线粒体增生，分布紊乱，明显肿胀，大小不一，部分线粒体肿胀成空泡样；嵴减少，排列紊乱，模糊不清。部分心肌细胞膜局部破裂（图3C）。DOX＋中剂量PGQ组大鼠心肌细胞膜无破裂，线粒体体膜完整，嵴较致密，基质颗粒较均匀，肿胀和空泡明显减轻（图3D）。

3 讨 论

本研究结果显示：PGQ能够明显改善DOX大鼠的一般状态和心功能，减轻心肌损伤，在心肌线粒体的保护作用上可能优于DZR，证实PGQ具有心脏保护作用。

由于DOX可造成不可逆的心肌损伤并最终导致大鼠心力衰竭，且其造模成功率高，因此常被用作构建蒽环类抗肿瘤药物心肌损伤模型。根据文献资料，本实验在预实验阶段采用15mg·kg－1DOX一次性腹腔注射给药，但实验过程中发现腹腔给药的大鼠较早开始出现死亡，解剖后发现大鼠出现大量腹水且部分大鼠出现血性腹水，大鼠腹腔黏连严重。有研究[5]发现：采用腹腔注射的方法造模死亡率高，死于腹水先于心力衰竭，可能不是合适的DOX给药途径，而尾静脉注射药物易外渗，局部坏死发生率高，因此本研究采用麻醉后股静脉注射方法，可避免腹腔注射的缺陷，且可在直视观察下保证药物全部进入大鼠血液循环中。

心功能是反映心肌损伤程度最直观的指标，经颈总动脉将心导管插入左心室检测心功能指标较体外行心脏彩超检查更为准确、客观。LVSP和＋dp/dtmax可反映心肌的收缩功能，实际值和恢复率越大则表明心肌收缩功能越好；－dp/dtmax反映心肌舒张功能，实际值绝对值和恢复率越大则心肌舒张功能越好。本研究结果显示：与对照组比较，DOX组大鼠LVSP、±dp/dtmax均显著降低，说明DOX对心肌造成了严重损伤。与DOX组比较，DOX＋DZR组和DOX＋中、高剂量PGQ组大鼠上述指标的改变明显减轻，表明PGQ可以改善左心室的收缩和舒张功能，减轻DOX所致的大鼠心功能下降。

TnI具有诊断窗口期宽、诊断阈值明确及检测快速等优点，特异性、敏感性强，可逐渐取代CK-MB成为判断心肌损伤的 “金标准”。大鼠与人类的TnI基因序列同源性为92.8%，大鼠心脏与人类心脏组织中TnI的分布大致相同，因此TnI可以用来观察在大鼠心肌损伤的指标。Bertinchant等[6]发现：异丙肾上腺素致大鼠急性心肌损伤模型中发现心肌组织学变化的严重性与心脏TnI浓度有关联，并且TnI比CK-MB和LDH指标在判断心肌损伤方面更敏感。在本研究前期实验中，心肌酶的检测结果很不稳定，受多种因素干扰，而TnI显示了良好的稳定性，所以本实验中便采用了TnI作为检测指标。本研究结果显示：DZR组大鼠TnI指标明显低于DOX组，而DOX＋中、高剂量PGQ组大鼠血清TnI也明显低于DOX组，与DOX＋DZR组比较未见明显差异，提示DOX＋中、高剂量PGQ可以明显减轻心肌损伤。

本研究观察到DOX组大鼠的心肌病变在光镜下表现为：心肌组织胞浆内出现明显空泡，有深色细胞核聚集于边缘，胞外间隙明显增宽。电镜下表现为心肌细胞膜局部破裂；线粒体分布紊乱、肿胀，外膜破损；嵴减少，排列紊乱，模糊不清，甚至断裂消失，基质减少，线粒体内大片空化。上述为DOX心肌损伤的典型表现，而DOX＋DZR和DOX＋PGQ组大鼠心肌病变显著减轻，本研究同时发现：在电镜下DOX＋PGQ组大鼠心肌细胞膜无破裂，线粒体体膜完整，嵴较致密，基质颗粒较均匀，肿胀及空泡明显减轻，比DOX＋DZR组保护作用更佳。研究[7－8]表明：线粒体是DOX所致心肌损伤的重要靶点，在电镜下所观察到的线粒体肿胀是一种早期代偿反应，以满足心肌细胞的能量供应，线粒体形态和功能的改变与DOX心脏毒性的发生和严重程度有关联。PGQ可以明显减轻DOX引起的心肌细胞膜和线粒体损伤，与延长大鼠生存率、改善大鼠心功能和降低大鼠血清TnI水平等心肌保护功能一致，表明PGQ具有良好的心脏保护作用，对心肌细胞膜及线粒体的保护作用可能优于DZR。

综上所述，PGQ能够拮抗DOX所致的心肌损伤，PGQ较DZR具有更好的心肌线粒体保护作用。但PGQ对心肌保护作用的机制有待进一步研究。

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