二次正交旋转组合设计优化水酶法提取猕猴桃籽油的工艺

方 芳 许凯扬 罗忠银 陈 颖

(长沙理工大学化学与生物工程学院，长沙 410114)

猕猴桃又名杨桃、藤梨、奇异果等，具有很高的营养、医疗、保健、观赏等开发利用价值，被誉为“水果之王”、“世界珍果”，是目前世界各国竞相发展的果品之一［1－3］。近年来，有关猕猴桃果脯、罐头、饮料等产品纷纷上市，而加工饮料一项就产生了大量猕猴桃籽。猕猴桃籽油中富含多种不饱和脂肪酸、脂类、黄酮类、酚类、维生素等物质，是目前发现亚麻酸含量较高的天然植物油，具有降低血脂、软化血管和延缓衰老等功效，在医学、保健和美容等领域具有广泛的用途，具有极高的开发利用价值［4］。萃取猕猴桃籽油的方法很多，但由于猕猴桃籽油耐热性能差，采用传统的热榨法萃取，油脂中营养成分及活性物质含量较低，不耐贮藏，产品损失较多，收率低，对其色泽产生的影响也较大［5－6］。水酶法是一种新兴的提油方法，它是以机械和酶解为手段破坏植物细胞壁，使油脂得以释放。该技术处理条件温和，工艺路线简单(无需脱溶，可直接利用三相离心分离油、水、渣)，而且可以同时萃取油和蛋白质，生产过程能耗相对低，废水中BOD与COD大为下降，污染少，易于处理［7－10］。试验以猕猴桃籽为原料，采用水酶法萃取猕猴桃籽油，并对其中的酶解条件进行研究，为猕猴桃籽油的萃取探索一条新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猕猴桃籽:湖南湘西“米良一号”猕猴桃的种子(主要成分是蛋白质、脂肪和矿物质，含油率31.32%，其中亚油酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸占75%以上)，购于湖南吉首，40℃烘干后用微型植物粉碎机粉碎成粉状(40目);Alcalase:诺维信公司，最适温度50～60℃，最适pH 8～10;其他所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

AL204电子天平:梅特勒－托利多(中国)公司，HH－8电热恒温水浴锅:上海比朗仪器有限公司，TGL18高速离心机:长沙英泰离心机厂，FZ102微型植物粉碎机:上海新诺仪器设备有限公司，101－3电热恒温鼓风干燥箱:郑州南北仪器设备有限公司。

1.3 试验方法

将洗净去杂后的猕猴桃籽于恒温干燥箱中烘干，再经粉碎机粉碎成粉状(40目)。每次试验时准确称取200.0 g于150 mL四颈瓶中，加入一定体积的蒸馏水，混匀、调整pH，然后加入一定量的酶，置恒温水浴锅中并用电动搅拌器不断搅拌，萃取结束后，在电炉上加热5 min灭酶，在4 000 r/min离心20 min，收集上层游离油，弃去乳状液及水解液，将残渣用200 mL蒸馏水洗涤，混匀，4 000 r/min离心10 min，收集上层游离油，将2次离心所得的游离油合并称重，然后称量计算出油率。出油率=萃取猕猴桃籽油量÷猕猴桃籽脂肪含量×100%。

1.4 试验设计与数据处理方法

1.4.1 单因素试验

准确称取猕猴桃籽粉末200.0 g，放入150 mL四颈瓶中，在其他条件相同的情况下，采用不同液料比、加酶量、酶解温度、酶解时间、酶解pH进行试验，逐个考察各影响因素对萃取效果的影响。

1.4.2 二次正交旋转组合设计试验

在单因素试验的基础上，本研究选取的工艺条件范围是:液料比6～14，酶用量1.5% ～3.5%，酶解温度40～60℃，酶解pH 8.0～10，选用四因素的二次正交旋转组合设计表进行试验，选取因素水平如表1所示。

表1 试验因素和编码水平表

1.4.3 数据处理方法

利用统计分析软件DPS(v3.01专业版)对试验结果进行分析。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果与讨论

2.1.1 液料比对猕猴桃籽出油率的影响

在酶解温度50℃，pH 9.0，酶解时间4 h，酶用量为2.5%的条件下，研究不同的液料比对猕猴桃籽出油率的影响，结果见图1。由图1可知，随着液料比的增加，猕猴桃籽的出油率快速上升，在液料比为10时达到最高。这可能是由于酶解时加入的水多有利于蛋白质的溶出，对酶解有利。当液料比大于10时，猕猴桃籽出油率反而有所下降，原因可能是加水量过多降低了酶与底物的浓度，降低了蛋白酶分子与底物分子的碰撞几率，从而使酶的作用效果下降，油萃取率降低，因此，选择液料比为10。

图1 液料比对猕猴桃籽出油率的影响

2.1.2 酶解温度对猕猴桃籽出油率的影响

在液料比10，酶解pH 9.0，酶解时间4 h，酶用量为2.5%的条件下，研究酶解温度对猕猴桃籽出油率的影响，结果见图2。由图2可知，随着酶解温度的升高，猕猴桃籽出油率不断上升，且上升趋势明显，在50℃时达到最高，出油率为25.46%，但当温度超过50℃时，随着温度升高萃取率迅速下降。这是因为在一定温度范围内，温度的提高增加了分子的动能，促进了扩散作用的进行，酶促反应也服从这个规律。但不同的是，酶是蛋白质，当温度升高至一定程度时，酶会发生变性，其活性中心的结构被破坏，会部分甚至完全失去其催化活性，从而降低酶解反应速度，根据试验确定最适宜的酶解温度为50℃。

图2 温度对猕猴桃籽出油率的影响

2.1.3 酶添加量对猕猴桃籽出油率的影响

在料液比10，酶解温度50℃，酶解时间4 h，pH 9.0的条件下，研究加酶量对猕猴桃籽出油率的影响，结果见图3。由图3可知，随着酶用量的增加，猕猴桃籽出油率不断升高，这是由于随着酶浓度的增大，反应速率加快，有利于油脂的释放，但当酶用量超过2.5%时，出油率增加缓慢，这说明当酶用量超过2.5%时，继续增加酶浓度对猕猴桃籽出油率贡献不大。因此，选择酶添加量为2.5%。

图3 酶用量对猕猴桃籽出油率的影响

2.1.4 酶解时间对猕猴桃籽出油率的影响

在料液比10，酶解温度50℃，pH 9.0，酶用量为2.5%的条件下，研究酶解时间对猕猴桃籽出油率的影响，结果见图4。由图4可知，随着酶解时间的延长，猕猴桃籽出油率不断上升，但当酶解时间超过4 h，出油率增幅很小。这说明酶解反应达到一定时间后，由于底物减少及抑制作用增强等原因，油脂的释放就不再进一步增加，出油率趋于恒定。因此，选择酶解时间为4.0 h。

图4 酶解时间对猕猴桃籽出油率的影响

2.1.5 酶解pH对猕猴桃籽出油率的影响

在料液比10，酶解温度50℃，酶解时间4 h，酶用量2.5%的条件下，研究酶解pH对猕猴桃籽出油率的影响，结果见图5。由图5可知，猕猴桃籽出油率随着酶解pH的升高而迅速增加，在pH 9.0时达到最高，出油率为25.46%。但当pH超过9.0时，萃取率随pH的升高而下降，这可能与碱性蛋白酶的最适酶解pH有关，当酶解pH偏离其最适pH时不利于碱性蛋白酶作用，酶活下降严重，细胞壁的破坏效果减弱不利于猕猴桃籽油的萃取。

图5 酶解pH对猕猴桃籽出油率的影响

2.2 水酶法提取工艺优化模型的建立

2.2.1 二次正交旋转组合设计方案及结果

由DPS(v3.01专业版)统计分析软件的试验设计功能可知，四因子二次正交旋转组合设计包括36个试验方案，具体试验方案及试验结果如表2所示。

表2 试验设计及结果

根据表2结果，建立猕猴桃籽出油率与液料比X1、酶添加量X2、酶解温度 X3、酶解 pH X4四因子的数学回归模型为:Y=26.184 17－0.223 33X1－

试验结果方差分析见表3。由方差分析可知:回归方程的失拟性检验 F1=2.089 ＜(10，11)=2.94，差异不显著，说明所选用的二次回归模型是适当的;回归方程的显著性检验 F2=15.451＞(14，21)=3.49，极显著，说明模型的预测值与实际值非常吻合，模型成立。对回归系数显著性检验，在a=0.10显著水平剔除不显著项，得到优化后的方程为:

表3 试验结果方差分析表

2.2.2 各因素的影响强弱分析

各因素的F值可以反映出各个因素对试验指标的重要性，F值越大，表明该因素对试验指标的影响越大，即重要性越大。从方差分析结果可知，各因素对猕猴桃籽出油率的影响强弱顺序为:液料比＞酶解pH＞酶添加量＞酶解温度。

2.2.3 双因素交互作用分析

由方差分析可知，X1、X2、X43个因素之间存在交互作用，分析结果见图6～图8。由图6～图8可知，随着液料比(X1)和酶添加量(X2)的增加，出油率呈上升趋势，达到一定程度时，出油率达到最大;但当液料比和酶添加量继续增加时，出油率开始下降。液料比(X1)与酶解pH(X4)具有正相关的协同作用，交互作用可获得更高的出油率，但当二者增大到一定值时，出油率增加不明显。酶添加量(X2)与酶解pH(X4)的交互作用表明，二者水平介于－2和0水平之间时，出油率随水平的增加而明显增加;当二者水平在0水平以上时，出油率随水平的增加而下降，这可能与碱性蛋白酶的最适酶解pH有关，当酶解pH偏离其最适pH时不利于碱性蛋白酶作用，酶活下降严重，细胞壁的破坏效果减弱不利于猕猴桃籽油的萃取。

2.2.4 提取工艺参数的优化及验证

采用频率分析法寻找最优萃取条件，其中出油率高于24.13%的方案有79个，频率分析结果见表4。由表4可知，在95%的置信区间内出油率高于24.13%的平均值优化萃取方案为:液料比10，酶添加量2.5%，酶解温度50℃，酶解pH 9.0。在此条件下进行验证试验，测得猕猴桃籽出油率为25.46%，与理论值(26.18%)接近，其相对误差为2.75%，验证了回归模型的适合性。

本试验用猕猴桃籽含油量为31.32%，在优化条件下，一次提取猕猴桃籽的出油率为25.46%，萃取率为81.30%;浸提2次猕猴桃籽出油率为27.17%，萃取率达86.75%。

表4 优化提取方案中Xi取值频率分布表

3 结论

3.1 通过二次正交旋转组合设计和二次多项式回归统计分析，得到水酶法提取猕猴桃籽油的4个主要影响因素液料比、加酶量、酶解温度、酶解pH与出油率之间的优化数学模型为:Y=26.184 17－，此模型在本试验范围内能较准确地预测猕猴桃籽的出油率。

3.2 通过方差分析可知，在本试验范围内，各因素对猕猴桃籽出油率影响强弱顺序依次为:液料比＞酶解pH＞酶添加量＞酶解温度。

3.3 采用频率分析法得到水酶法提取猕猴桃籽油的最优工艺条件为:液料比为10，酶添加量2.5%，酶解温度50℃，酶解pH 9.0，酶解时间4h，提取2次。在此条件下，猕猴桃籽的出油率为27.17%，萃取率达 86.75%。

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