米渣肽抗疲劳作用及抗疲劳肽的分离鉴定

刘 晶 温志英 韩清波

(河北经贸大学生物科学与工程学院1，石家庄 050061)(石家庄君乐宝乳业集团有限公司2，石家庄 050221)

米渣是制造怡糖、葡萄糖、味精、淀粉、糊精等过程中产生的副产品。目前多将其干燥后用作动物饲料，但工业附加值低［1］。米渣中蛋白质量分数60%以上，是大米含量的5～8倍，且高于大豆蛋白(含量35% ～40%)，是良好的蛋白质资源［2］。用酶法水解米渣蛋白，不但能充分利用米渣中的蛋白质，还可产生具有生物活性的大米小分子肽。人体小肠吸收氨基酸的能力差，而对相对分子质量小于1 000的寡肽极易吸收利用，已经证明一些寡肽具有特殊的生理功能如抗疲劳特性［3］。许多研究表明动物和人类进行体育运动可使自由基的产生增加。正常情况下，体内不断产生活性氧(ROS)，但不会对机体产生严重的损害。如果ROS产生过多或抗氧化能力下降，体内ROS代谢出现失衡，导致产生氧化应激或氧化损伤，从而使机体产生疲劳。Singh等［4］用抗氧化剂灌喂小鼠，发现摄入抗氧化物质提高了小鼠体内还原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的水平，减少了脂类的过氧化，这表明体内抗氧化能力的提高，表现在小鼠在游泳过程中静止时间的减少，即延缓了疲劳的产生［5］。Wang 等［6］发现，猪胰脏中的十肽(Pro－Thr－Thr－Lys－Thr－Tyr－Phe－Pro－His－Phe)可以提高游泳耐力，延缓疲劳。这一肽段中富含Pro、Tyr、His和Phe等具有抗氧化性的氨基酸。Yu等［7］发现具有高自由基清除活性(62%的超氧阴离子清除活性和96%的羟基自由基清除活性)的脱脂大豆肽可以显著延缓小鼠的游泳疲劳。此外草鱼肽也具有抗疲劳的作用［8］。米渣肽抗疲劳特性的研究对开发新的抗疲劳肽具有重要作用。抗疲劳米渣肽的分离鉴定对深入研究肽的抗疲劳机理具有理论意义。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

大米渣:武汉味全食品有限公司;葡萄糖试剂盒、乳酸试剂盒、游离脂肪酸试剂盒、血尿素氮试剂盒和糖原试剂盒:南京建成生物工程中心;碱性蛋白酶:诺维信;大孔树脂DA201－C:天津市海光化工有限公司;色谱分析试剂为色谱纯;其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Zorbax SB－C18色谱柱:美国 Agilent;SuperdexTM Peptide 10/300 GL色谱柱和 KTA avant25液相色谱仪:美国GE Healthcare Life Sciences;PPSQ－31A蛋白测序仪:日本Shimadzu Corporation。

1.3 方法

1.3.1 米渣肽的制备工艺［9］

米渣→加水→调pH→调温→加酶(碱性蛋白酶)→酶解(调pH)→灭酶→离心→上清液→米渣肽纯化→真空干燥(米渣肽)。1.3.2 米渣肽的纯化及分级

用大孔吸附树脂 DA201－C(装于2.5 cm×30 cm层析柱)净化以除去米渣中的可溶性糖和盐。在 pH 6.0条件下，控制样品流速为0.75 BV/h，用去离子水洗脱乳糖和盐。然后用75%的乙醇洗脱，流速为0.5 BV/h，在220 nm处测定洗脱液的吸光度。收集洗脱峰物质(米渣肽，RSP)［10］。采用不同截留相对分子质量(1 000和5 000)的超滤膜对米渣肽进行分离。得到米渣肽Ⅰ(RSPⅠ，相对分子质量＜1 000)、米渣肽Ⅱ(RSPⅡ，相对分子质量 1 000～5 000)和米渣肽Ⅲ(RSPⅢ，相对分子质量 ＞5 000)。

1.3.3 常规成分的测定

蛋白质含量的测定:参照 GB 5009.5—2010［11］;脂肪含量的测定:参照 GB 5413.3—2010［12］;含水量的测定:参照 GB/T 5009.3—2010［13］;灰分含量的测定:参照 GB/T 5009.4—2010［14］。

1.3.4 样品和小鼠处理

50只小鼠被分为5组(每组n=10)。每组实验鼠分别灌胃如下分组中的物质，灌胃剂量为1.5 g蛋白/kg体重:(1)对照组(0.9%生理盐水);(2)RSP组;(3)RSPⅠ组;(4)RSPⅡ组;(5)RSPⅢ组。上述所有样品都溶解在0.9%的生理盐水中，给实验鼠的灌胃剂量为每天200μL，持续6周。

1.3.5 游泳耐力试验

试验用 Bostrom 等［15］和 Kamakura 等［16］的方法经过略微的改动进行测定。小鼠的游泳能力是通过在一个装满水的深度为35 cm(90 cm×45 cm×45 cm)的丙烯酸塑料池内测定的。池内水温控制在(34±1)℃。这些鼠的尾部负载有大约其体重的8%的铅护套。若鼠在5 s内不能到水面呼吸则说明它们已经疲劳，记录时间即为游泳疲劳时间。游泳运动在每周的第7天进行。为了避免实验鼠体力活动的昼夜变化，游泳运动在11:00到17:00进行，经证实，在这个时间段，鼠的耐力变化最小。在第6周的最后一天，实验鼠游泳过后迅速被杀死以供进一步的研究。

1.3.6 血浆生化指标的分析

用肝素管进行全血的标本采集。血浆在4℃以1 000 r/min 离心10 min，然后于 －70 ℃保存［17－18］。葡萄糖、乳酸、游离脂肪酸(NEFA)和血液中尿氮(BUN)的含量是用商业试剂盒进行分析的。

1.3.7 米渣肽的分子筛色谱分离

取1 mg样品用20 mm磷酸缓冲液溶解到1 mL，并离心(12 000 r/min，离心10 min)取上清。采用 KTA avant 25系统和 SuperdexTM Peptide 10/300 GL柱子。进样体积为100μL，平衡缓冲液为20 mm磷酸缓冲液(pH 7.0)，进样流量为 0.6 mL/min，在214 nm检测。

1.3.8 米渣肽的反相高效液相色谱(RP－HPLC)纯化

1.3.9 肽的氮端测序

利用混合氨基酸标准品，在常规条件下运行生成一张标准品色谱图;对混合氨基酸标品的保留时间进行校正，生成标准方法文件。将反相纯化出来的样品离心后取上清，备用;将聚凝胺15μL加到玻璃纤维膜上，氮气吹干;上机将玻璃纤维膜预处理，即运行5个循环;将足量样品点加到预处理后的玻璃纤维膜上，氮气吹干。将加好样品的玻璃纤维膜用滤膜封置于蛋白测序仪PPSQ－31A的反应器里，设定检测氨基酸数及其他参数。

1.4 数据处理

数据均以平均值±标准差(Mean±SD)表示，组间显著性比较采用SPSS 11.5数据处理软件进行单项方差分析(S－N－K)，显著性P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 米渣肽的成分分析

由表1可以看出，不同组之间的蛋白质含量有显著差异，为了排除蛋白含量的不同对米渣肽抗疲劳性的影响，灌胃小鼠的蛋白含量是相同的。不同组之间脂肪和灰分的含量也具有显著性差异。Tong等［18］发现，乳糖、矿物质、其他低分子质量化合物和磷脂没有抗疲劳作用，说明花生粕蛋白是抗疲劳的主要物质。因此，他们是否对抗疲劳特性有影响在这里没有讨论。

表1 米渣肽的成分

2.2 小鼠游泳疲劳时间的变化

由表2可以看出，在第1周时，虽然灌胃RSP和不同相对分子质量的肽组分都可以延长小鼠游泳时间，但不同组之间的游泳疲劳时间没有显著性差异(P＞0.05)。在第2周时，仅RSPⅠ组与对照组有显著性差异(P＜0.05)，但和RSP组之间没有显著性差异。第4周和第6周时，RSPⅠ组不仅与对照组有显著性差异(P＜0.05)，而且与RSP组有显著性差异(P＜0.05)。在第6周时，与对照组相比，RSPⅡ和RSPⅢ可以显著延长游泳时间(P＜0.05)，但与RSP组相比没有显著性差异(P＞0.05)。低相对分子质量的米渣肽(相对分子质量＜1 000)显著延长游泳时间，说明低分子肽具有一定的抗疲劳效果。

表2 灌胃不同物质小鼠游泳时间的变化

2.3 小鼠血浆中葡萄糖、乳酸、NEFA和BUN的含量

回想当年广东王朝的建立，正是源于完备而专业的青训系统。杜锋、朱芳雨、王仕鹏从青涩的黄毛小子逐步成为队中主心骨，在老大哥李群带领下摧毁了八一王朝，宣告广东宏远的时代来临。随后宏远队8夺CBA总冠军追平八一队纪录建立属于自己的广东王朝。期间，陈江华、刘晓宇、苏伟、周鹏、董瀚麟、王征、高尚、陈大伟、季乐、于梁、曲绍斌等大批年轻才俊如雨后春笋不断充实宏远后备阵容，板凳深度傲视前联盟。

如表3所示，在5组小鼠中，RSPⅠ组血浆葡萄糖值最高，与其他组(RSPⅡ组除外)相比有显著性差异(P＜0.05)。与对照组相比，所有的米渣肽都可以提高血浆中的葡萄糖含量，但RSP、RSPⅡ和RSPⅢ组之间没有显著性差异(P＜0.05)。与对照组和RSP组相比，RSPⅠ组可以显著降低血乳酸的含量，但其他组之间没有显著性差异。各组间NEFA和BUN含量没有显著性差异(P＞0.05)。

表3 游泳疲劳后小鼠血浆生化参数

血乳酸是厌氧糖酵解的产物，高强度的运动如游泳可以引发酵解刺激物如ADP、AMP和磷酸的聚集。由于ATP的供给和消耗不均衡，加速了糖酵解的速率和丙酮酸的产生，导致乳酸的生成。血乳酸的含量通常都作为评价疲劳的生化指标。RSPⅠ可以显著降低血乳酸的含量，因此低分子肽具有良好的抗疲劳作用。血糖是剧烈运动最先消耗的能量物质，RSPⅠ组的血糖含量最高，可以延缓由于血糖降低引起的不良变化，从而延缓疲劳。脂肪酸的利用率提高，相应的NEFA含量增加，这意味着脂肪代谢增加，相应的降低了葡萄糖的利用，提高了运动能力［19］。虽然RSPⅠ与对照组和RSP组比可以提高NEFA的含量，但没有显著差异，说明灌胃低相对分子质量肽对小鼠这一指标的影响不明显。灌胃低分子肽可以提高蛋白质的吸收性，但灌胃RSPⅠ没有显著提高BUN的含量。综上，相对分子质量＜1 000的肽可以显著延缓小鼠的疲劳。

2.4 米渣肽的分子筛色谱分离

由图1可以看出米渣肽组成复杂，相对分子质量小于1 000的米渣肽经分子筛色谱分离后具有多个峰，取优势峰物质Y1作为纯化的目标肽。

图1 RSPⅠ的分子筛高效液相色谱分离图

2.5 Y1的RP－HPLC纯化

分子筛液相色谱是通过分子的大小和形状的不同分离目标物质的，因此得到的峰物质Y1是分子大小和形状相近的肽。为了保证Y1的纯度，需要对Y1进一步纯化。RP－HPLC是根据分子疏水性的差异进行肽的分离。两种色谱的分离原理不同，具有相近分子质量及形状的肽疏水性可能差异很大，因此通过两种方式的色谱分离可以使分离后的肽的纯度提高。将Y1通过RP－HPLC分离纯化后，得到一个纯化的肽P1，结果如图2所示。

图2 肽P1的反相高效液相色谱分离图

2.6 组分P1的氮端测序结果

通过蛋白测序仪测定肽P1的氨基酸组成如图3所示，P1肽段共有5个氨基酸，组成为Gln－Ser－Pro－Glu－Ile。

图3 Edman降解后的肽P1氨基酸序列图

根据前人研究，N－端具有疏水性氨基酸如缬氨酸和异亮氨酸的肽具有较高的抗氧化活性，因为疏水性氨基酸，可以捕捉自由基［20－21］。在多肽链，高含量的Pro，Tyr和 His可以提高肽的抗氧化能力。肽P1 N－末端是Ile，且肽链中含有Pro，Ile等抗氧化氨基酸，这是肽P1具有高抗氧化性的原因。给小鼠灌胃具有高抗氧化性肽可以延缓自由基引发的疲劳，这是低分子质量肽具有抗疲劳效果的原因。

3 结论

3.1 采用碱性蛋白酶对米渣进行酶解，酶解的产物经大孔树脂纯化得到RSP。通过超滤分离，得到RSPⅠ(相对分子质量＜1 000)、RSPⅡ(相对分子质量1 000～5 000)和RSPⅢ(相对分子质量＞5 000)3种米渣肽组分。

3.2 与对照组和RSP组相比，RSPⅠ可以显著延长小鼠游泳的疲劳时间和小鼠血糖含量，并显著降低血乳酸含量。因此相对分子质量＜1 000的低相对分子质量肽可以显著延缓小鼠的运动疲劳。

3.3 采用高效液相色谱对小分子肽进行纯化，得到一个优势小肽，对其序列进行分析，得到它的氨基酸组成为Gln－Ser－Pro－Glu－Ile。根据其组成氨基酸的特点，发现这个肽具有高抗氧化性，可以延缓由自由基引发的疲劳。

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