不同方法提取蚕蛹油的GC－MS分析

林春梅 周鸣谦

(淮海工学院食品工程学院，连云港 222005)

蚕蛹(silkworm pupa)又名小蜂、蝶元、蚕女，为蚕蛾科家蚕(Bombyxmori L.)的蛹，是缫丝工业的主要副产品［1］。蚕蛹营养丰富，富含蛋白质、脂肪、维生素、矿物质等，其中不饱和脂肪酸质量分数超过70%，人体必需脂肪酸α－亚麻酸含量高，不仅具有很高的营养价值，而且具有多种药理作用。我国蚕蛹资源丰富，除少量鲜食外，年均仍有近10万吨干蚕蛹可供利用。但由于缺乏深加工技术，这些蚕蛹大部分加工成饲料和肥料或腐败废弃，少部分深加工成蚕蛹罐头、蚕蛹精油、蚕蛹蛋白、多肽、氨基酸、蛹油软胶囊等，用于食品、工业、医药、生物防治等领域［2－5］。其中，蚕蛹精油是以新鲜蚕蛹为原料，经除杂、除臭等精炼而成，富含不饱和脂肪酸尤其是α－亚麻酸，为医药、保健食品、营养食品及高档化妆品的优质原料是近年来开发研究热点。

目前，提取蚕蛹油的方法主要包括有机溶剂浸出法、压榨法、索氏提取法及超临界 CO2萃取法等［6－12］。大部分学者研究重点集中于浸出法和超临界CO2萃取法工艺方面，对提取的蚕蛹油中脂肪酸种类和含量研究较少［13－15］。本研究着重于考察索氏提取法和超临界CO2萃取法对蚕蛹油提取率、GCMS法分析两种方法得到的蚕蛹油脂肪酸组成和含量，为高品质蚕蛹油工业生产提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

桑蚕蛹:山东省栖霞市农贸市场购得;CO2(纯度＞99.0%)连云港特殊气体有限公司提供;试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器和设备

HA 221－50－06型超临界萃取仪:南通市华安超临界萃取设备有限公司;LX－06A 300g多功能粉碎机:江西省赣州市赣云食品机械厂;DHG－9035电热鼓风干燥箱:上海一恒科学仪器有限公司;HW·YS数显恒温水浴锅:浙江舟山市定海区海源仪器厂;索氏提取器:山东甄城永兴仪器厂;Agilent 6890N/5973i气相色谱－质谱仪:美国Agilent科技有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 蚕蛹预处理

山东省栖霞市农贸市场购得桑蚕蛹，适量温水洗净，置电热鼓风干燥箱中60℃烘至含水量低于5%，粉碎，过40目筛，备用。

1.3.2 蚕蛹油的索氏提取法工艺

工艺流程:干燥蚕蛹→粉碎过筛→称量→装料→索氏抽提4 h左右→回收石油醚→挥干残留石油醚→蚕蛹油。

索氏提取操作:精确称取15 g样品，滤纸包好置索氏抽提器中，脂肪瓶中加入石油醚150 mL，恒温水浴温度设为50℃，虹吸次数为8～10次/h，回流提取4 h左右，观察提取筒中液体颜色变得很浅时，停止加热，从抽提管下口滴一滴石油醚于滤纸上，挥发后不留下油迹，说明抽提完全，回收石油醚，至脂肪瓶中剩余石油醚极少量，置烘箱中60℃过夜，挥干残留石油醚。重复3次，计算得到每份样品的蚕蛹油提取率，然后计算平均提取率。

索式提取法蚕蛹油提取率=提取得到的蚕蛹油质量/蚕蛹粉质量×100%

1.3.3 蚕蛹油的超临界萃取

工艺流程:干燥蚕蛹→粉碎过筛→称量→装料密封→升温升压至设定值→萃取→分离→蚕蛹油。

超临界萃取:分别精确称取200 g样品置于超临界CO2萃取仪的萃取釜中，在CO2流量为20 kg/h的条件下，设定不同的萃取压力，在萃取时间为120 min时，各个压力下的得率有显著差别，有助于分析，所以选用120 min作为萃取时间。通过单因素试验获得萃取温度、萃取压力、分离温度、分离压力4个参数的大致范围，设计四因素三水平正交试验，每个处理做3个重复，计算出每个处理的平均提取率。

超临界CO2法蚕蛹油提取率=萃取得到的蚕蛹油质量/装料质量×100%

1.3.4 正交试验

以蚕蛹油的提取率为指标，在单因素试验的基础上，进行了工艺条件优化试验。选择萃取温度(A)、萃取压力(B)、分离温度(分离釜Ⅰ温度C)、分离压力(分离釜Ⅰ压力D)为变量，进行四因素三水平正交试验(表1)，每次装料200 g。CO2流量为20 kg/h，萃取时间120 min，每个处理做3个重复，计算每个处理的平均提取率。

表1 因素水平表

1.3.5 蚕蛹油脂肪酸GC－MS分析

1.3.5.1 样品处理

甲酯化:取2滴蚕蛹油于10 mL具塞试管中，加入2.0 mL 5%氢氧化钾－甲醇溶液摇匀，于60℃恒温水浴皂化至油珠消失，冷却至室温后加入2.0 mL14%三氟化硼－甲醇溶液，摇匀，于60℃恒温水浴3 min，冷却至室温，加入2 mL正己烷，饱和氯化钠1mL，摇匀、静置，离心后取其上层溶液用于气相色谱－质谱分析。

1.3.5.2 色谱条件

气相色谱分析条件:色谱柱:122－7032DBWAX 柱(30 m ×0.25 mm，0.25 μm);升温程序:170℃以6.0℃/min升至230℃保持 6.0 min;载气(He)流速1.0 mL/min，压力2.4 kPa，进样量10 μL;分流比10:1。

质谱分析条件:电子轰击(EI)离子源;电子能量70 eV;接口温度250℃;离子源温度200℃;扫描质量范围m/z 33～450，扫描速率150次/min;全扫描方式。

2 结果与分析

2.1 索氏提取法提取率

3份15 g样品，经索氏提取，得到的蚕蛹油提取率如表2所示，平均为27.8%。

表2 索氏提取法得到的蚕蛹油提取率

2.2 超临界CO2萃取蚕蛹油的正交试验

选取L9(34)正交表进行正交试验。试验结果见表3。

表3 正交试验结果

表4 方差分析表

采用直观分析法分析表3数据，结果说明，各因素对蚕蛹油提取的影响程度依次为A ＞B ＞D＞C，即萃取温度＞萃取压力＞分离压力＞分离温度。最佳工艺条件为A2B2C2D1，即:萃取温度40℃，萃取压力30 MPa，分离温度50℃，分离压力10 MPa。采用A2B2C2D1组合工艺进行验证试验，此条件下蚕蛹油的提取率为19.22%，高于其他组合，与索氏提取法得到的蚕蛹油提取率相比较低，为此，采用最佳工艺进行二次提取，综合两次提取结果，提取率为24.01%，但仍然低于索氏提取法。表4方差分析表明，四种因素对结果的影响都没达到显著水平，结果受因素综合影响更大一些。超临界法得到的蛹油颜色明亮黄色，香味更纯正。

2.3 蚕蛹油脂肪酸组成及含量分析

蚕蛹油脂肪酸的GC－MS图见图1、图2(扣除了溶剂峰)，蚕蛹油的脂肪酸成分及相对含量见表5。

从表5中可以看出，索氏提取法得到的蚕蛹油GC－MS分析鉴定出24个成分，3.23 min处得到正己烷，5.37 min处得到苯，6.86 min处得到二十二烷，12.56 min处得到十五烷;超临界法得到的蚕蛹油GC－MS分析鉴定出22个成分，6.84 min处得到十六碳酸，12.55 min处得到2，3－二甲基十七碳烷。除此之外，这两种方法得到的蚕蛹油GC－MS分析成分基本相同。

表5 索氏提取法及超临界CO2法得到的蚕蛹油中脂肪酸成分及相对含量

索氏提取法得到的蚕蛹油饱和脂肪酸主要组成成分:硬脂酸8.16%，软脂酸18.24%;不饱和脂肪酸主要组成成分:油酸35.69%，亚油酸6.20%，α－亚麻酸26.93%。其中油酸含量最高，其次是α－亚麻酸，总不饱和脂肪酸质量分数为70.18%。除此之外，还有少量的正己烷0.07%，苯1.25%，疑为对样品进行甲酯化处理过程中带入。超临界CO2萃取蚕蛹油主要饱和脂肪酸成分:硬脂酸7.66%，软脂酸18.81%;不饱和脂肪酸主要组成成分:油酸35.86%，亚油酸6.00%，α－亚麻酸28.03%，总不饱和脂肪酸质量分数为71.15%，较索氏提取法得到的蛹油中不饱和脂肪酸含量稍高。

3 讨论与结论

两种提取方法相比，石油醚索氏提取法提取蚕蛹油效率高，平均可达27.80%，超临界CO2萃取法一次提取率为19.22%，二次提取率可达24.01%，与索氏提取法相近。两种方法得到的蚕蛹油经GC－MS分析，所含脂肪酸种类基本相同，都为硬脂酸、软脂酸、花生酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等。各种脂肪酸含量差别不大，其中，超临界CO2法得到的蛹油中总不饱和脂肪酸质量分数为71.15%，α－亚麻酸质量分数为28.20%，而索氏提取法得到的蛹油中总不饱和脂肪酸质量分数为70.18%，α－亚麻酸质量分数为26.93%。

索氏提取法是一种测定食品中粗脂肪含量的经典方法，可将蚕蛹中绝大部分油脂溶出，但此方法一次处理原料量有限，并且需保证蛹粉的干燥，否则所用溶剂会吸收样品中水分造成非脂成分溶出，通过这种方法得到的产品纯度差，溶剂难以完全挥发，影响产品后续的精制。超临界CO2萃取法是一种新型的无毒溶剂萃取技术，利用超临界CO2流体在不同温度和压力下利用对不同物质的溶解度差别将其分离，工艺简单，生产成本低，特别适用于脂溶性、高沸点、热敏性物质的提取［13］。本研究采用这种技术得到的蚕蛹油无腥味臭味，色泽亮黄，与索氏提取法得到的黄色半透明，略有腥味的蛹油相比较，更利于实现精制蚕蛹油的工业化生产。本课题的研究结果可为蚕蛹油的开发利用提供参考。

［1］浦锦宝，陈锡林.蚕蛹的理化性质及农药残留量的研究［J］.中国中药杂志，2002，27(5):381

［2］Nadia R.Pereiraa，Osvaldo Ferrarese － Filhob，Makoto Matsushita，et al.Proximate composition and fatty acid profile of Bombyx mori L chrysalis toast［J］.Journal of Food Composition and Analysis，2003，16:451 －457

［3］Feny Mentang，Masashi Maita，Hideki Ushio，et al.Efficacy of silkworm(Bombyx mori L.)chrysalis oil as a lipid source in adult Wistar rats［J］.Food Chemistry，2011，127:899 –904

［4］ U.K.Majumder，A.Sengupta.Triglyceride composition of chrysalis oil，an insect lipid ［J］.Majumder and Sengupta:Triglyceride of an Insect Lipid，1979(6):620 －623

［5］林高堂，蒋立文.蚕蛹综合利用研究进展［J］.蚕桑通报，2006，37(2):1 －4

［6］Milan Certik1，Robert Horenitzky.Supercritical CO2extraction of fungal oil containingγ－linolenic acid［J］.Biotechnology Techniques，1999，13:11 – 15

［7］Kil－ Yoon Kang，Dong － Hyun Ahn，Gordon T.Wilkinson，et al.Extraction of lipids and cholesterol from squid oil with supercritical carbon dioxide［J］.Korean Journal of Chemistry and Engeering，2005，22(3)，399 －405

［8］P.Bhattacharjee，R.S.Singhal.Extraction of squalene from yeast by supercritical carbon dioxide［J］.World Journal of Microbiology ＆ Biotechnology，2003，19:605 –608

［9］Harrison Lik Nang Lau，Yuen May Choo，Ah Ngan Ma et al.Quality of residual oil from palm－pressed mesocarp fiber(elaeis guineensis)using supercritical CO2with and without ethanol［J］.Journal of the American Oil Chemists'Society，2006，83(10):893 －898

［10］何春茂.用超临界CO2萃取技术提取植物有效成分的研究［D］.南宁:广西大学，2001:1

［11］朱莉，罗士数，张海德，等.槟榔籽油的超临界CO2萃取及其成分分析［J］.食品科学，2010，31(24):151－154

［12］陆占国，李伟.索氏法提取酸浆果籽油及其成分分析［J］.中国粮油学报，2010，25(12):75 －77，99

［13］王国基，颜辉，王俊.超临界CO2萃取蚕蛹油的工艺研究［J］.蚕业科学，2006，32(4):525 －529

［14］李志东，张洪林，王战勇，等.柞蚕蛹油的提取研究［J］.氨基酸和生物资源，2006，28(1):80－82

［15］魏兆军，廖爱美，于力涛，等.家蚕蛹油提取工艺优化研究［J］.食品科学，2007，28(10):248 －251.