高效液相色谱法测定人纤维蛋白原中甘氨酸、盐酸精氨酸含量

陈通威，高红琴，崔素梅，张惠兰，王宗刚

(山西康宝生物制品股份有限公司，山西 长治 046011)

人纤维蛋白原主要是作为凝血因子Ⅰ而直接参与凝血过程[1]，是由健康人血浆经低温乙醇法分离提取后，再经病毒去除和灭活处理，最后冻干制成。冻干过程是一个复杂的相变过程，在冻结、冻融、干燥和储存过程中存在着多种影响因素[2]。而冻干保护剂是影响制品冻干效果的主要因素[3]。甘氨酸、盐酸精氨酸是一种理想的蛋白保护剂。本试验中旨在建立一种含量测定方法，用于生产过程中甘氨酸、盐酸精氨酸含量的监控及成品的检定。

1 仪器与试药

P2000型高效液相色谱仪)，OV－2001型柱温箱(美国TSP公司);UV1000型紫外检测仪(美国TSP公司);LDZS－Z型台式离心机(北京医用离心机厂)。甘氨酸对照品(批号为624－200104)、盐酸精氨酸对照品(批号为624－200104)、天门冬氨酸对照品(批号为624－200104)均来自中国药品生物制品检定所;乙腈，三乙胺，正己烷，异硫氰酸苯酯，磺基水杨酸，盐酸，醋酸钠，乙腈为色谱级，其余试剂为分析纯。1mol/L三乙胺乙腈溶液，0.1mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液，1.5%磺基水杨酸溶液，0.1 mol/L 盐 酸 溶 液 ;样 品 (批 号 为 20100101，20100102，20100203，山西康宝生物制品股份有限公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[4－7]与系统适用性试验

色谱柱:Kromisil C18柱(250mm ×4.6mm，5μm);流动相:A为 0.1 mol/L醋酸钠(pH=6.5)－ 乙腈(93∶7)，B 为乙腈 － 水(4∶1)，梯度洗脱(表1);进样量:20μL;柱温:38℃;检测波长:254 nm;流速:1.0mL/min。理论板数按盐酸精氨酸峰计算应不低于3000。在此色谱条件下甘氨酸、盐酸精氨酸峰与其它色谱峰之间分离度良好。从色谱图1A可知，甘氨酸峰保留时间为7.590min，盐酸精氨酸峰保留时间为8.041min，内标物天门冬氨酸峰保留时间为4.028min。按盐酸精氨酸峰计算理论板数为29 697，甘氨酸、盐酸精氨酸与内标物质峰的分离度符合要求。从色谱图1B可知，甘氨酸、盐酸精氨酸与内标物质峰及其他杂质峰的分离度符合要求。

表1 流动相梯度洗脱表

2.2 溶液制备

分别称取甘氨酸、盐酸精氨酸对照品适量，精密称定，置同一量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液制成每1mL约含甘氨酸、盐酸精氨基酸0.6mg的溶液，得对照品溶液。称取内标物天门冬氨酸适量，精密称定，加0.1 mol/L盐酸溶液制成每1 mL中约含天门冬氨酸2 mg的溶液，得内标溶液。精密量取复溶后的样品1 mL，加1.5%磺基水杨酸溶液9mL，混匀，静置30min，以3000 r/min离心10min，取上清液，用0.1mol/L盐酸溶液稀释5倍，得供试品溶液。

图1 高效液相色谱图

2.3 测定法

分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各100μL，置离心管中，依次各加 0.1 mol/L盐酸溶液200μL，内标溶液 50μL，0.1mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液50μL，1mol/L三乙胺乙腈溶液50μL，混匀，室温放置1 h，加入正己烷400μL，摇匀，静置10 min，取下层溶液，滤过，即得衍生化的对照品溶液和供试品溶液。精密量取衍生化的对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。按内标法以峰面积计算，即得。精密量取对照品溶液100μL，按上述方法衍生处理，进样。

2.4 方法学考察

线性关系考察:分别精密量取对照品溶液30，50，70，100，130μL，各加0.1mol/L盐酸溶液适量，衍生，进样，记录色谱图。以氨基酸的质量浓度 C(g/L)为横坐标、峰面积与内标峰面积的比值(f)为纵坐标回归计算。甘氨酸回归方程为 Y=3.413 2X－0.071 6，r2=0.996 8;盐酸精氨酸回归方程为 Y=0.978 7X －0.039 9，r2=0.998 2。结果表明，甘氨酸在 0.186 8 ～0.809 4 g/L范围内线性关系良好，甘氨酸测定质量浓度为0.4 g/L，在线性范围之内;盐酸精氨酸在0.186 3～0.807 3 g/L范围内线性关系良好，盐酸精氨酸测定质量浓度为0.6 g/L，在线性范围之内。

精密度试验:精密量取对照品溶液100μL，按上述方法衍生处理，连续进样5次。分别测得甘氨酸、盐酸精氨酸峰面积与内标峰面积的比值(f)。结果甘氨酸 RSD为1.37%，盐酸精氨酸 RSD为0.88%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:取批号为20100101的供试品1份，按供试品溶液制备方法制样、衍生，室温下放置，分别在0，2，4，8 h时进样，分别测得甘氨酸、盐酸精氨酸峰面积与内标峰面积的比值(f)。结果甘氨酸 RSD为1.51%，盐酸精氨酸 RSD为1.94%，表明溶液稳定性良好。

加样回收试验:取批号为20100101的供试品，精密加入处方量80%，110%，115%的甘氨酸、盐酸精氨酸，混匀，稀释1倍，分别精密量取100μL，衍生化后，每份进样20μL，计算样品回收率。结果见表2。

表2 甘氨酸与盐酸精氨酸加样回收试验测定结果(n=6)

重现性试验:取 3批样品(批号为 20100101，20100102，20100203)，在不同时间，不同实验室间进行重现性试验。结果甘氨酸 RSD分别为1.9%，1.8%，1.9%，盐酸精氨酸 RSD分别为1.4% ，1.6%，1.7% ，表明方法重现性良好。

2.5 样品含量测定

取3批样品，依法测定，计算含量。结果见表3。

表3 样品含量测定结果(g/L)

3 讨论

目前国内外报道的测定甘氨酸、盐酸精氨酸含量的高效液相色谱法有多种，但多为仅测定1种氨基酸的方法。按2010年版《中国药典(三部)》的方法，所用的化学组件包价格昂贵，高效液相需要三泵，检测成本较高，相对于规模较小的单位，其应用受到制约。

高效液相色谱柱前衍生化法有多种衍生剂可供使用。预试验结果表明，利用异硫氰酸苯酯乙腈溶液和三乙胺乙腈溶液柱前衍生反相高效液相色谱法测定人纤维蛋白原中甘氨酸、盐酸精氨酸含量，分离效果较佳，保留时间适宜。该方法简便可靠，专属性好，重现性好，适用性较强，且试验材料便宜、易得，可以作为人纤维蛋白原中甘氨酸、盐酸精氨酸含量的测定方法。

[1]徐修才，吴竞生，翟志敏.人纤维蛋白原的研究进展[J].国外医学:临床生物化学与检验学分册，2004，25(6):503－505.

[2]孙东坡，胡一桥.蛋白质冷冻干燥制品中的保护剂及其保护机制[J].药学进展，2003，27(4):202 －205.

[3]刘占杰，华泽钊.蛋白质药品冷冻干燥过程中变性机理的研究进展[J].中国生化药物杂志，2000，21(5):263－265.

[4]杨昭鹏，曾文珊，杨晓晖，等.脑蛋白水解物注射液的质量研究Ⅱ[J].药物分析杂志，2003，23(2):106－108.

[5]李爱菊，郑宏强，熊爱琴.小牛血去蛋白提取物注射液中游离氨基酸的含量测定[J].中国药业，2006，15(7):40.

[6]赵艳红，王 强，陈兆梅.柱前衍生化HPLC法测定人纤维蛋白原中精氨酸的含量[J].药学实践杂志，2006，24(5):270－271.

[7]国家药典委员会.中华人民共和国药典(三部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:附录41.