瓜蒌－薤白药对用于抗大鼠急性心肌缺血时对MAPK信号通路的影响＊

雷 燕，黄 芳，韩林涛，但汉雄，严标文，李明明

(1.湖北中医药大学药学院，湖北 武汉 430065;2.湖北中医药大学中药教研室，湖北 武汉 430065;3.湖北中医药大学中药资源与中药复方教育部重点实验室，湖北 武汉 430065)

现代药理研究表明，瓜蒌－薤白药对对心肌缺血及心肌缺血缺血－再灌注损伤有较好的疗效，其改善作用可能与扩管、减轻钙超载、抗氧化、保护血管内皮等有关[1－7]。近年来随着对心肌缺血保护机制的深入研究，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路与心肌缺血的相关性备受关注。最新研究表明，MAPK通路可能是预处理和后处理保护心肌、抑制损伤的细胞内信号通路机制的共同靶点。因此，从MAPK信号通路阐明药物的保护机制出发，极有希望寻找到理想的治疗策略以减轻心肌缺血的损伤[8－11]。笔者在前期基础上，用SD大鼠建立心肌缺血模型，从MAPK信号转导途径深入探讨瓜蒌薤白改善急性心肌缺血的作用机制，以期阐释瓜蒌－薤白药对治疗胸痹的物质基础及作用机理，从而为最终阐明方剂配伍规律与内涵提供科学依据。现报道如下。

1 材料和方法

1.1 药物、动物及仪器、试剂

药物:瓜蒌实、薤白药材购自于武汉刘有余药业有限责任公司。瓜蒌－薤白药对和单味药均由湖北中医药大学中药资源与中药复方教育部重点实验室自制。瓜蒌煎液，取瓜蒌皮250 g、瓜蒌籽250 g与12%乙醇600mL共煎，减压浓缩至400mL。薤白煎液，薤白250 g与12%乙醇600mL共煎，减压浓缩至400mL。瓜蒌－薤白煎液，取瓜蒌实和薤白(500 g∶250 g)与白酒7 L(低浓度米酿酒，1 400mL)共煎，减压浓缩至2 L(400mL))。为确保试验结果的可比性，同一样品的所有试验都用同一批药材。含生药量瓜蒌－薤白煎液为1.875 g/mL，瓜蒌煎液为1.25 g/mL，薤白煎液为 0.625 g/mL。

动物:健康SD雄性大鼠，体重150～200 g，清洁级，由华中科技大学同济医学院提供，合格证号为SCXK(鄂)2010－0007。

试剂:SDS－PAGE凝胶制备试剂盒，目录号为G2003，PMSF(100mmol/L)，目录号为G2008，均购于谷歌生物。超敏ECL化学发光试剂盒BeyoECLPlus，目录号为P0018，购于碧云天生物技术研究所(Beyotime Institute of Biotechnology)。Tween－20，目录号为 0777，Amresco公司;蛋白 Marker(10－170 kDa)，目录号为sm0671，Fermentas公司;Actin，货号为 SC －1616R，SANTA 公司。一抗:BS4322 p－JNK1/2/3(T183/Y185)，BS5016 p－ERK1/2(T202/Y204)，BS4766 p－p38(Y182)，均购于 Bioworld公司。二抗:HRP标记兔抗山羊，目录号为14－13－06;HRP标记山羊抗兔，目录号为074－1506;HRP标记兔抗小鼠，目录号为074－1806;HRP标记兔抗大鼠，目录号为14－16－06;均购于KPL公司。2.5% 戊二醛:赛莫飞世尔生物化学制品有限公司，批号为NUH0180，201011563。

仪器:BL－420S型生物机能试验系统，HX－100E型小动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司);DYY－6C型电泳仪(北京市六一仪器厂);752－P型紫外可见光分光光度计(上海现科仪器有限公司);Neofuge 15R型冷冻离心机(Heal Force公司);WD－9405A型脱色摇床(北京六一仪器厂);HITACHI7080型全自动生化分析仪(日本HITACHI公司);LKB－V型超薄切片机(瑞典BROMMA公司);日立H－600型透射电镜(日本日立公司);冷冻离心机;－80℃低温冰箱。

1.2 试验方法

动物分组及处理:50只SD大鼠随机分为5组，假手术(SHAM)组、瓜蒌薤白(TKAM)组(18.75 g/kg)、瓜蒌(TK)组(12.5 g/kg)、薤白(AM)组(6.25 g/kg)、模型(I/R)组，每组 10只。假手术组和模型组灌胃0.9%氯化钠注射液，每日灌胃1次，灌胃容量为10.0mL/kg，连续灌胃14 d。各组大鼠用10% 水合氯醛麻醉，固定，采用标准肢体Ⅱ导联连续心电监测。行气管插管，连接小动物呼吸机。经左冠状动脉左前降支下浅层心肌穿一5/0号丝线，假手术组仅穿线不结扎，其余各组均立即打活结结扎冠状动脉左前降支(LAD)，以同步心电图ST段抬高及心脏局部紫绀为结扎成功标志，形成急性心肌缺血，缺血30min。

组织标本采集与检测:取试验后的大鼠心肌组织，固定于2.5%戊二醛，0.1mmol/L磷酸缓冲液漂洗3次，再用锇酸(O3O41%)固定，0.1 mmol/L磷酸缓冲液漂洗3次，酒精梯度脱水(50%，70%，80%，95%，100%2 次)、每次 15min。纯丙酮脱水 2 次(15min)，EPON812:丙酮(1 ∶1)浸透 30min，纯包埋液浸透 1 h，纯包埋液固化37℃ 24 h后60℃ 48 h。用LKB－V型超薄切片机(瑞典BROMMA公司)切片，行铀、铅染色(醋酸双氧铀，枸橼酸铅)。用H－600型透射电镜(日本日立公司)观察(×15 000倍)。

Western Blot法测定MAPKs表达:心肌缺血研究试验结束后，取各组心肌组织，提取左心室组织蛋白;取蛋白样品用于聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白;上样，电泳;采用湿式转膜方式检测ERK1/2，p38MAPK，C－Jun蛋白表达，一抗为兔抗人单克隆抗体，二抗为HRP标记的羊抗兔IgG;ECL自显影技术观察蛋白的表达，从MAPKs信号通路研究药对瓜蒌－薤白药对改善急性心肌缺血心肌损伤的保护作用及机制。

2 结果

2.1 对大鼠急性缺血心肌组织学的影响

假手术组为正常心肌细胞，润盘清晰可见，肌纤维组织排列整齐;模型组线粒体极度肿胀，灶空化，嵴排列凌乱或崩解，肌纤维扭曲;瓜蒌组较模型组稍有改善，肌纤维排列扭曲，可见部分灶空化和嵴排列紊乱;薤白组肌纤维结构无明显扭曲，细胞间质有水肿;瓜蒌薤白组线粒体有轻度肿胀，肌纤维排列整齐。详见图1。

图1 电镜下大鼠急性心肌缺血心肌组织切片(75 KV×15 000)

2.2 对大鼠急性缺血MAPKs的表达

由AlphaEase FC凝胶图像分析软件取灰度值，结果见表1。可见，与瓜蒌、薤白、瓜蒌薤白组相比，假手术组心肌P－p38表达极少。瓜蒌薤白、薤白、瓜蒌组两两比较，P－p38表达依次降低，假手术组P－p38表达较少。有研究显示[12]，把模型组的心肌暴露于高含氧量的环境，心肌功能障碍和梗死面积可大大减轻，而p38MAPK却大量磷酸化，进一步提示了瓜蒌－薤白煎液可抑制被激活的p38信号通路，减少由其引起的心肌损伤，对心脏起到保护作用。此外，由表1也可看出，给药组与模型组中，P－JNK的表达在瓜蒌薤白组中最少，说明瓜蒌－薤白药对抑制了JNK通路的表达，同样也降低了由于急性心肌梗死引起的心肌损伤，从而起到了保护心脏的作用。各个给药组依次比较，可以看出，在瓜蒌薤白药对的诱导作用下，各给药组P－ERK的表达均依次增加。

表1 瓜蒌薤白对大鼠心肌急性缺血MAPKs通路的表达结果

3 讨论

近年来，对瓜蒌－薤白药对中瓜蒌、薤白单味药的药理研究较多。为了深化瓜蒌－薤白药对的药理学研究，更好地利用瓜蒌、薤白资源，本试验验探讨了瓜蒌－薤白药对单用与配伍后大鼠抗急性心肌缺血心肌损伤中心肌组织学的影响和MAPKs信号通路在其中的作用。且本次试验在已有文献研究的基础上[13－14]，选取了相对居中的瓜蒌－薤白煎液的有效质量浓度(1.875 g/mL)，进一步证明了以下结论:瓜蒌薤白配伍后抗心肌组织损伤的效果更显著;3种丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路参与了瓜蒌薤白抗大鼠急性心肌缺血所致心肌损伤作用的分子机制，并起到了不同的作用，且瓜蒌－薤白药对配伍后的结果更明显。

丝裂素活化蛋白激酶(MAPKs)是一组丝氨酸－苏氨酸激酶系，受各种刺激激活，如生长因子和细胞应激等。哺乳动物细胞内证实3种主要的MAPKs信号途径包括细胞外信号相关蛋白激酶(ERK1/2)，p38MAPK和c－Jun氨基端蛋白激酶(JNKs)/应激活化蛋白激酶(SAPKs)。活化的MAPKs转位入核后引起转录因子磷酸化，提高应激蛋白基因转录水平，合成相关蛋白质，从而发挥心肌保护作用。

已有研究证实，MAPKs信号转导通路存在于大多数细胞内，在将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并在引起细胞生物学反应(如细胞增殖、分化、转化及凋亡等)的过程中具有至关重要的作用。目前，已发现存在着多条并行的MAPKs信号通路，不同的细胞外刺激可使用不同的MAPKs信号通路，通过其相互调控而介导不同的细胞生物学反应[15]。其中，细胞外信号调节蛋白激酶ERK(extracellular signal－relat－ed kinase)是重要的信号转导途径之一，可调节细胞的多种生理功能，是传递丝裂原信号的信号转导蛋白。它正常定位于胞浆，有丝分裂原刺激后部分类型的ERK能向细胞核转位，并具有调控转录活性的能力，调节转录因子活性，产生细胞效应。JNK是一种应激激活的蛋白激酶，由于JNK信号转导途径在细胞应激反应中起重要作用，并被多种细胞外应激信号激活，因而JNK也被称为应激活化蛋白激酶(SAPK)。SAPK信号转导途径极其复杂，并与ERK及p38MAPK等信号转导途径有密切关系。

p38丝裂原活化蛋白激酶信号传导通路在炎症、应激、凋亡、细胞周期和生长的多种生理和病理过程中发挥着重要作用。p38在细胞核内和胞质都有表达。在应激条件下，胞质内的p38可以转移到核内，通过磷酸化激活各种转录因子调控相关基因的表达。有报道称[16]，缺血使p38磷酸化的程度很小，但本试验可以证明，在瓜蒌－薤白药对的作用下，p38的磷酸化会显著增高，提示给药后的心肌缺血可使大量细胞因子激活，进一步推论出p38的磷酸化与心肌缺血引起的心肌损伤产生的过氧化物激活有关[17]。

心肌缺血及缺血－再灌注损伤在中医学中属于“胸痹”“心痛”等范畴。栝蒌薤白半夏汤出自《金匮要略·胸痹》篇，是临床治疗胸痹的有效方。该方可通过调节血管内皮细胞产生的一氧化氮和内皮素平衡有效防治急性心肌缺血损伤[18－19]。本试验通过建造心肌缺血－再灌注模型，观察MAPKs信号转导通路的表达来研究瓜蒌薤白药对对急性缺血损伤心肌的影响及可能性机制。本研究结果显示，与I/R组对照其他各组中，TKAM组P－p38、P－JNK的表达与SHAM组最为接近，而P－ERK的表达在TKAM组中最多。由此推论，瓜蒌薤白煎液能有效抑制大鼠急性心肌缺血心肌损伤，其机制之一可能与MAPKs的3条信号通路的活化相关。

MAPKs 3种信号途径均可在心肌缺血－再灌注损伤过程中激活。如缺血前激活心肌细胞中ERK信号通路，对于介导心脏内源性保护配体有着一定的作用[20]。p38MAPKs和JNK/SAKPs是急性心肌缺血后心肌凋亡信号转导的关键因子，在决定心肌缺血损伤程度方面扮演了重要角色[21－22]。

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