连花清瘟胶囊质量标准研究

许红辉，李晓燕，张永锋，李正杰，李向军

(河北以岭医药研究院，河北 石家庄 050035)

连花清瘟胶囊为我院自行研发的中药六类新药，具有自主知识产权，由连翘、金银花、麻黄、甘草等药味组方。为有效控制其内在质量，对方中金银花、甘草、大黄、薄荷脑、麻黄进行了薄层色谱(TLC)鉴别，并采用高效液相色谱(HPLC)法测定了制剂中连翘苷的含量[1]。现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent1100型高效液相色谱仪;VWD紫外检测器。连花清瘟胶囊(石家庄以岭药业股份有限公司，批号为110246);金银花对照药材(批号为 121060－200605)、绿原酸对照品(批号为110753－200413)、甘草对照药材(批号为 121303－200502)、大黄对照药材(批号为121249－200402)、薄荷脑对照品(批号为110737－200312)、连翘苷对照品(批号为 110821－200711)、盐酸麻黄碱对照品(批号为171241－200506)，均购自中国药品生物制品检定所;乙腈(Fisher，色谱纯)，其余试剂、试药均为分析纯，水为乐百氏纯净水。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

金银花:取本品6粒内容物，加甲醇10 mL，超声10 min，滤过，滤液蒸干，残渣用10mL水溶解，转移至分液漏斗，用乙醚振摇提取2次，每次10mL，醚层弃去，水层用水饱和的正丁醇10mL振摇提取1次，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液;取金银花对照药材1 g，加甲醇8mL，超声处理10min，过滤，滤液为对照药材溶液;取绿原酸对照品适量，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液;称取处方量1/10、除金银花外的方中药材，按制备工艺制得阴性样品，按供试品溶液的处理方法处理，制成金银花阴性对照品溶液。照薄层色谱法[2010年版《中国药典(一部)》附录ⅥB]试验，吸取上述4种溶液各4～8μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸丁酯－甲酸－水(7∶2.5 ∶2.5)的上层液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(365 nm)下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相对应的位置上至少显2个相同颜色的荧光斑点，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点;阴性对照无干扰(见图1 A)。

甘草:取甘草对照药材1 g，置具塞三角瓶中，加甲醇8mL，超声10min，滤过，滤液作为对照药材溶液;称取处方量1/10、除甘草外的方中药材，按制备工艺制得阴性样品，按供试品溶液的处理方法处理，制成甘草阴性对照品溶液。照薄层色谱法[2010年版《中国药典》(一部)》附录ⅥB]试验，吸取金银花鉴别项下供试品溶液4～8μL，对照药材溶液及阴性对照品溶液各4μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷－甲醇－水(13∶6∶2)10℃以下放置的下层液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%的硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的主斑点;阴性对照无干扰(见图1 B)。

图1 主药薄层色谱图

鱼腥草、大黄:取本品8粒内容物，加乙醇10mL，超声处理10min，取上清液作为供试品溶液。取大黄对照药材0.1 g，加甲醇3mL，超声处理10min，取上清液作为对照药材溶液;另取鱼腥草对照药材0.5 g，加甲醇5mL，超声处理20min，滤过，滤液作为对照药材溶液。称取处方量1/10、除大黄或金腥草外的方中药材，按制备工艺制得阴性样品，按供试品溶液的处理方法处理，制成大黄或鱼腥草阴性对照品溶液。照薄层色谱法[2010年版《中国药典(一部)》附录Ⅵ B]试验，吸取上述溶液各4～8μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷 －乙酸乙酯 －甲酸(8∶2∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品溶液色谱中，在与鱼腥草或大黄对照药材溶液色谱相应位置上至少2两个相同的橙黄色荧光斑点或至少显3个相同颜色的荧光主斑点(见图2)。

图2 鱼腥草及大黄薄层色谱图

麻黄:取盐酸麻黄碱对照品适量，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。称取处方量1/10、除麻黄外的方中药材，按制备工艺制得阴性样品，按供试品溶液的处理方法处理，制成麻黄阴性对照品溶液。照薄层色谱法[2010年版《中国药典(一部)》附录ⅥB]试验，吸取上述对照品溶液与鱼腥草或大黄鉴别项下供试品溶液各5～10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸丁酯 －甲酸 －水(20∶4∶0.5)的上层液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相对应位置上显相同的紫红色斑点;阴性对照无干扰(见图1 C)。

薄荷脑:取本品4粒内容物，加石油醚(60～90℃)5 mL，振摇2min，滤过，滤液作为供试品溶液。另取薄荷脑对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。称取处方量1/10、除薄荷脑外的方中药材，按制备工艺制得阴性样品，按供试品溶液的处理方法处理，制成薄荷脑阴性对照品溶液。照薄层色谱法[2010年版《中国药典(一部)》附录ⅥB]试验，吸取上述3种溶液各4～8μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷－乙酸乙酯 －甲酸(8∶2∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%香草醛硫酸溶液，105℃烘至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相对应位置上显相同颜色的斑点;阴性对照无干扰(见图1 D)。

2.2 连翘苷含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Agilent Zorbax SB － C18柱(150mm ×4.6mm，5μm);流动相:乙腈－0.1%磷酸溶液(22∶78);流速:1mL/min;检测波长:205 nm;进样量:10μL。在此条件下，色谱图见图3。理论板数按连翘苷峰计算应不低于3 500。

2.2.2 溶液制备

取连翘苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1mL含4μg的溶液，即得对照品溶液。取本品装量差异项下内容物，研细，取0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇20 mL，密塞，称定质量，超声处理(功率为250W，频率为40 kHz)20min，放冷，密塞，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5mL，加在中性氧化铝柱(100～200目，3 g，内径为1 cm)上，用水洗脱至25mL的容量瓶中，收集洗脱液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验:称取处方量1/10、除连翘外的方中药材，按制备工艺制得阴性样品，按供试品溶液的处理方法处理，制成阴性对照品溶液。按拟订的色谱条件进行检测，结果阴性无干扰(见图3)。

线性关系考察:分别精密吸取质量浓度为 1.647 6，2.746，5.492，10.297 5，13.73，20.595，68.65 μg/mL 的连翘苷对照品溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪，按拟订的色谱条件测定，以连翘苷峰面积积分值为纵坐标、进样量(ng)为横坐标绘制标准曲线，得回归方程 Y=6.948X+29.016，r=0.9999 6(n=7)。结果表明，连翘苷进样量在16.476～686.5 ng范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

精密度试验:精密吸取对照品溶液及相应质量浓度的供试品溶液，分别进样5次，测定峰面积。结果对照品的 RSD为0.51%，供试品的 RSD为0.59%(n=5)，表明仪器精密度良好。

图3 高效液相色谱图

稳定性试验:分别精密吸取连翘苷对照品溶液、供试品溶液各 10 μL，于配制后 0，2，6，10，24 h 时测定。结果对照品、样品中连翘苷峰面积的 RSD分别为0.66%和0.72%(n=5)，表明溶液在24 h内稳定。

重复性试验:取同批次样品9份，按低、中、高3个量级(0.4，0.5，0.6 g)取样，每个取样量各制备 3份供试溶液，依法测定。结果样品中连翘苷平均含量为0.852 mg/g，RSD为1.46%(n=9)，表明方法重复性良好。

加样回收试验:取同批次已知含量的样品9份，分为3组，分别加入低、中、高3种质量浓度的连翘苷对照品溶液，按供试品溶液制备方法制备待测溶液，依法测定，计算回收率。结果见表1。

不同厂家及批号氧化铝考察:取同一批样品，按供试品溶液处理方法超声提取、滤过后，各精密量取续滤液5mL，分别加在不同批次或厂家的中性氧化铝柱(100～200目，3g，内径为1 cm)上，分别用水洗脱至25mL的量瓶中，依法测定连翘苷的含量。结果见表2。

表1 连翘苷加样回收试验结果(n=9)

3 讨论

大黄、鱼腥草薄层色谱鉴别时，采用了同样的供试品溶液，既缩短了样品制备周期又节能环保;采用同样的展开剂，简便易行，节约了人力物力，且取得了较好的薄层色谱鉴别效果，故此项鉴别方法值得推广。

含量测定选择检测波长时，对连翘苷对照品溶液进行光谱检测，结果连翘苷在200，227，277 nm波长处均有吸收，为降低样品取样量，故仍选择205 nm为样品的检测波长。另外，洗脱溶剂采用水而不是不同浓度的乙醇、甲醇了[1]等化学试剂，更加节能环保，且降低了检验成本。

表2 不同厂家及批次氧化铝考察试验结果

综上所述，文中建立的薄层色谱法鉴别专属、斑点专属，含量测定方法简便、快捷、准确、环保，适用于产品的质量控制。

[1]张雪光，宫立新，李雪松，等.高效液相色谱法测定双黄连口服液中连翘苷的含量[J].中国药业，2004，13(9):44 －45.