CD55蛋白的表达在大鼠神经病理性疼痛发病机制中的作用

朱海娟，王金保

前期研究证实神经病理性疼痛大鼠脊髓背角发生补体异常激活，且此处高表达的补体蛋白在动物模型痛觉过敏的形成和发展中发挥重要作用［1-3］。为了探索CD55蛋白作为重要的补体调节蛋白，在神经病理性疼痛(NPP)的发病过程中是否发挥作用，本研究制作NPP大鼠慢性坐骨神经缩窄损伤模型(CCI)、保留性脊神经损伤模型(SNI)，测定大鼠脊髓中CD55蛋白表达情况，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 60只健康清洁级SD大鼠(河北医科大学动物实验中心提供，动物合格证号:冀医动管字703058号)，雄性，体重200～250 g。随机分为假手术组、CCI组、SNI组3组，每组20只。室温(20±2)℃，严格12 h明暗交替光照，给予充足的水源和饲料。适应环境7 d后进行实验，所有实验均在白天进行，大鼠的使用和喂养严格遵照河北医科大学伦理委员会和动物保护协会所规定的有关条款执行。

1.2 主要仪器和试剂 仪器:RTY-1型热痛刺激仪(第四军医大学生理教研室研制);BME-403型Von frey机械刺激仪(中国医学科学院生物工程研究所提供);BB16uv型CO2恒温培养箱(德国Heraeus公司生产);恒温摇床(重庆医用器材厂生产);Gel Doc 2000凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司生产)。试剂:兔抗大鼠CD55多克隆抗体，批号:CD55(H-319):sc-9156，美国Santa Cruz公司生产;辣根酶标记的山羊抗兔IgG(H+L)亲和纯化二抗，购自北京中山生物技术有限公司。

1.3 模型的制作 制作大鼠CCI和SNI模型:①CCI模型:大鼠俯卧位捆绑，从后肢上部切开皮肤，分离肌肉，暴露坐骨神经主干，使用羊肠线环绕坐骨神经主干并单结固定，羊肠线应能够在坐骨神经主干上滑动。②SNI模型:于大鼠后肢上缘切开皮肤，分离肌肉，暴露坐骨神经主干及其下的分支——胫神经、腓总神经和腓肠神经，结扎并剪断胫神经和腓总神经，保留细小的腓肠神经，并避免损伤［4］。假手术组:大鼠只暴露坐骨神经，不予结扎，然后逐层缝合。

1.4 行为学测定 分别在术前、术后1 d、3 d和7 d进行痛阈值测定。

1.4.1 热痛阈测定:用RYT-1型热痛刺激仪测大鼠热缩足潜伏期(paw withdrawal thermal latency，PWTL)。参照文献［5］方法进行，于上午8:00～12:00测定，先将大鼠放在热刺激仪的玻璃操作台上适应5 min，调节光强度，单次照射时间不超过30 s，以免造成热辐射损伤，每肢照射3次，取其平均值。为避免或减少一次刺激对随后刺激效应造成的影响，同一部位刺激的间隔时间为5 min。

1.4.2 机械痛阈测定:参照文献［6］的方法测定机械缩足阈值(PWMT)，将大鼠置于升高的金属网上，并盖以透明的有机玻璃罩，适应20 min，用不同压力的纤维丝(从小到大)垂直刺激其足底2、3跖趾间皮肤敏感处，逐渐加压使之成为S形并持续6～8 s，观察是否出现缩足反应，大鼠在刺激时间内或在移开Von frey纤维时立即出现快速的缩足反应，记为阳性反应，而身体活动所引起的缩足反应不记作阳性反应。每次间隔5 s，连续10次，诱发4～6次缩足反应作为50%反应率，其压力值即为阈值。

1.5 免疫组化染色 采用SP法对大鼠脊髓标本进行免疫组化染色。腹腔注射1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后，经左心室灌注200 ml生理盐水和300 ml 4%多聚甲醛溶液，充分固定后，纵向剖开椎管，取腰4～6脊髓组织，固定 24 h，经脱水、透明，石蜡包埋切片，切片厚度为4 μm。石蜡切片经二甲苯透明，常规梯度乙醇脱蜡，浸入0.01 mol/L、pH值为6.0的枸橼酸盐溶液中，加热至98℃进行抗原修复30 min，3%H2O2去离子水室温孵育20 min，正常兔血清封闭液室温孵育20 min。滴加兔抗大鼠CD55多克隆抗体4℃孵育过夜，同时用PBS代替兔抗大鼠CD55多克隆抗体作为阴性对照。PBS液充分洗涤后，加入辣根酶标记兔抗山羊 IgG 37℃孵育30 min。DAB显色，苏木精复染，透明、封片。在OLYPUS显微镜下观察，胞膜和胞质中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，以CD55阳性细胞数(随机取5个高倍视野，以其平均值作为一个标本的阳性细胞数)表示各切片CD55蛋白的相对表达水平。

1.6 Western blot检测 采用Western blot法测定大鼠脊髓背角CD55蛋白的表达。于术后第7天处死大鼠取腰4～6段脊髓背角，将少量组织置于1.5 ml EP管中，加入裂解液，超声匀浆，4℃下14000 r/min离心15 min，取上清，采用BCA法测定蛋白浓度。取40 μg蛋白上样品，8%(w/v)SDS-PAGE 电泳，半干转法转膜。印迹膜片用5%脱脂奶粉封闭1 h，大膜片加入抗大鼠CD55单克隆抗体，小膜片加入羊抗actin抗体，4℃过夜。用 Tris/0.05%吐温 －20(TBST)洗膜(5 min×3)，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗(山羊抗鼠 IgG)，37℃孵育1 h，TBST充分洗膜(5 min×3)，TBS洗膜10 min。最后印迹膜片与强化学发光试剂ECL温浴l min，X光胶片曝光30～60 s，经显影和定影显示特异的蛋白信号。大膜片经膜再生液再生(37℃孵育30 min)后孵育鼠抗NR2B抗体，程序同前。信号条带扫描后，用Quantity one 4.5.0图像分析软件进行定量分析，以与β-actin条带的光密度比值反映CD55蛋白表达的相对水平。

1.7 统计学分析 采用SPSS 13.0统计学软件进行分析，计量资料采用均数±标准差(±s)表示，组内采用t检验、组间采用重复测量数据方差分析，α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 痛阈值情况 与术前相比，术后1 d 3组大鼠PWTL和PWMT都降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。术后第3、7天CCI组、SNI组与术前及假手术组同时点比较PWTL和PWMT持续降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。而假手术组大鼠痛阈值逐渐恢复到术前水平，见表1。

2.2 脊髓背角免疫组化染色结果 假手术组脊髓背角阳性细胞数(16±4)个，CCI组(6±2)个，SNI组(10±3)个。假手术组明显多于 CCI组和SNI组，差异有统计学意义(P＜0.05)。SNI组与CCI组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。见图1、2。

2.3 Western-blot实验结果 β-actin条带的光密度积分(IOD)一致，即总蛋白上样量一致。假手术组大鼠脊髓背角 CD55表达量为1.15±0.26，CCI组为0.37 ±0.19，SNI组为 0.51 ±0.22。与假手术组相比，CCI组、SNI组大鼠脊髓背角CD55表达量显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图3。

表1 3组大鼠痛阈值比较(±s)

表1 3组大鼠痛阈值比较(±s)

注:与本组术前相比，aP＜0.05;与假手术组同时点相比，cP＜0.05

组别 鼠数 热缩足潜伏期(s)机械缩足阈值(g)假手术组20术前 17.3 ±2.5 14.2 ±1.9术后1 d 13.7 ±1.7a 9.5 ±3.1a术后3 d 16.6 ±2.3 13.8 ±2.8术后7 d 16.8 ±2.2 13.7 ±2.5慢性坐骨神经缩窄损伤模型组 20术前 17.5 ±1.9 14.8 ±3.2术后1 d 12.8 ±3.2a 7.6 ±1.9a术后3 d 11.6 ±2.1ac 8.8 ±2.5ac术后7 d 11.9 ±3.0ac 8.2 ±1.4ac保留性脊神经损伤模型组 20术前 17.7 ±2.9 13.9 ±2.0术后1 d 14.0 ±2.2a 7.8 ±1.5a术后3 d 12.8 ±1.8ac 7.4 ±2.2ac术后7 d 13.4 ±3.5ac 7.8 ±1.7ac

图1 3组大鼠脊髓背角CD55阳性细胞表达情况(SP×400)

图2 3组大鼠脊髓背角CD55阳性细胞数柱状图

图3 3组大鼠脊髓背角CD55蛋白的表达情况

3 讨论

正常情况下，体内产生相当数量的补体调节蛋白，以特定的方式与补体相互作用，使补体的激活和抑制处于平衡状态。补体调节蛋白包括可溶性蛋白和膜结合型蛋白两类。可溶性蛋白包括C1抑制物、C4结合蛋白、H因子、I因子、S蛋白等，主要在血清中发挥调节作用;膜结合型补体调节蛋白包括膜辅助蛋白(CD46)、CD55、调节素(CD59)及补体受体1等，前三者主要表达在细胞膜上，防止自身组织遭受补体攻击［7-8］。

CD55蛋白表达于所有外周血细胞、内皮细胞和黏膜上皮细胞表面，可同C2竞争与C4b的结合，从而抑制C4b2b形成并促进其分解，也可促进Bb从已形成的C3bBb中解离［9-10］。CD55蛋白作为补体调节蛋白在补体级联反应的开始就发挥调节作用，其在补体调节蛋白家族中地位显著，意义重大。

关于补体调节蛋白在中枢神经系统疾病中的研究已有大量报道。Bonifati［11］报道 CD55表达下调是帕金森患者脑内补体异常活化的重要因素。Emmerling［12］指出补体调节蛋白的表达异常是海默森患者发病的元凶。但补体调节蛋白在NPP中的研究尚属首次。前期研究表明，在NPP形成过程中脊髓背角发生异常的补体活化，许多补体蛋白表达增高。为了增加本项研究的可靠性和重复性，本研究建立了两种外周损伤型NPP模型，采用目前测定大鼠痛阈值的可靠技术热痛刺激方法和机械痛刺激方法评估动物模型的稳定性，于建模后第7天断头处死大鼠，采用免疫组化技术和免疫印迹技术对模型大鼠脊髓中的CD55蛋白进行测定。结果显示，两种NPP模型脊髓中CD55蛋白水平在建模后表达发生了不同程度的降低，与假手术组相比有显著差异。本研究结果与前期我们发现NPP时脊髓背角发生级联反应是一致的。当外周神经发生损伤时，痛觉信号传入中枢，脊髓背角胶质细胞活化，表达大量补体蛋白，进而触发级联反应［13-15］。正常情况下，由于细胞膜上表达的CD55蛋白可干扰C3转化酶和C5转化酶，阻断补体级联反应，保护自身细胞免受伤害。当CD55缺乏或表达下调时，补体级联反应加剧，大量膜攻击复合物形成，攻击邻近的神经元，使其内部构象改变，从而将伤害性信号上传，经过大脑的信息整合，形成痛觉过敏。因此可以推测，NPP模型大鼠脊髓中CD55的表达下降可能是此处发生补体异常活化的原因，至少是触发因素之一。而有关NPP时脊髓中补体调节蛋白CD55表达下调的机制需要做进一步研究。

［1］王金保，王琪，聂发传，等.脊髓补体C3蛋白在大鼠神经病理性痛维持中的作用［J］.中华麻醉学杂志，2008，28(1):49-52.

［2］王金保，王姝媛，王琪，等.眼镜蛇毒因子对神经病理性疼痛大鼠脊髓背角神经元的保护效应［J］.临床麻醉学杂志，2010，26(4):1129-1133.

［3］王金保，聂发传，王姝媛，等.脊髓背角补体异常活化与神经病理性疼痛关系的实验研究［J］.国际麻醉学与复苏杂志，2009，30(3):222-228.

［4］金小高，罗爱林，王金韬，等.脊髓神经元和胶质细胞激活在三种神经病理性疼痛大鼠模型脊髓水平致痛机制中的作用［J］.中华麻醉学杂志，2006，26(1):71-74.

［5］胡兴国，范素贞，张云翔，等.脊髓NF-κB信号通路在大鼠持续性术后痛中的作用［J］.中华麻醉学杂志，2011，31(7):833-836.

［6］高峰，田玉科，杨辉鞘，等.鞘内移植 h P P E修饰INPC对大鼠慢性神经病理性痛的镇痛效应［J］.中华麻醉学杂志，2007，27(3):264-267.

［7］Wang Y L，Kaplan H J，Puran S，et al.Suppression of Complement Regulatory Proteins(CRPs)Exacerbates Experimental Autoimmune Anterior Uveitis(EAAU)［J］.J Immunol，2006，177(12):7221-7231.

［8］陈雪丹，白云，熊加祥，等.原代培养的小鼠星形胶质细胞CD46、CD55、CD59的表达及炎症刺激因子对其的影响［J］.第三军医大学学报，2006，28(10):1029-1031.

［9］张海谱，单保恩，艾军，等.ALDHI和CD55表达在乳腺癌预后评估中的意义［J］.解放军医学杂志，2010，35(1):20-23.

［10］王芹，张玲，张维东，等.胃癌组织衰变加速因子表达及其临床意义的研究［J］.中华肿瘤防治杂志，2008，15(9):683-686.

［11］Bonifati D M，Kishore U.Role of complement in neurodegeneration and neuroinflammation［J］.Mol Immunol，2007，44(5):999-1010.

［12］Emmerling M R，Watson M D，Raby C A，et al.The role of complement in Alzheimer＇s disease pathology［J］.Biochim Biophys，2000，1502(1):158-171.

［13］Robert S G，Michael C，Gary J B，et al.Complement Induction in Spinal Cord Microglia Results in Anaphylatoxin C5a-Mediated Pain Hypersensitivity［J］.J Neurosci，2007，27(32):8699-8708.

［14］Levin M E，Jin J G，Ji R R，et al.Complement activation in the peripheral nervous system following the spinal nerve ligation model of neuropathic pain［J］.Pain，2008，137(1):182-201.

［15］Li M，Peake P W，Charlesworth J A，et al.Complement activation contributes to leukocyte recruitment and neuropachic pain following peripheral nerve injury in rats［J］.Eur J Neurosci，2007，26(12):2486-3500.