高效液相色谱法测定三维樟柳碱膜中氢溴酸樟柳碱含量

兰玉坤，梁 静

(重庆市食品药品检验所，重庆 400121)

氢溴酸樟柳碱是从茄科植物唐古特山莨菪根中提取的生物碱的氢溴酸盐，作为抗胆碱药，能解除血管痉挛，改善病损区的微循环及局部营养代谢，使病损区黏膜达到正常角化，促进炎症恢复，有消除口腔斑纹的功能[1]。三维樟柳碱膜为口腔科用药，方中含有维生素A、维生素E和氢溴酸樟柳碱，在现行检验标准中只进行了定性检验，没有定量检验方法。三维氢溴酸樟柳碱膜中氢溴酸樟柳碱的含量较少，而且辅料对樟柳碱的吸附作用较大。为有效控制氢溴酸樟柳碱的含量，首先要使样品中的樟柳碱完全溶出，在此基础上建立了测定氢溴酸樟柳碱含量的高效液相色谱法。氢溴酸樟柳碱、氢溴酸东莨菪碱以及硫酸阿托品均为托烷类生物碱，化学结构十分相近，因此将此3种组分作为考察对象，并对色谱条件进行优化考察。

1 仪器与试药

Agilent 1100型高效液相色谱仪;二极管阵列检测器。氢溴酸樟柳碱(批号为 100399－200601)、氢溴酸东莨菪碱(批号为10049－200308)以及硫酸阿托品(批号为100040－200510)对照品均由中国药品生物制品检定所提供;三维樟柳碱膜(批号分别为110301，110302，110303，成都第一制药有限公司);所用试剂均为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Waters C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:0.02 mol/L 磷酸二氢钾溶液(pH=3.5)－ 乙腈(93 ∶7);流速:1.0 mL/min;检测波长:210 nm;进样体积:100 μL;柱温:30 ℃ 。在此条件下，理论板数按氢溴酸樟柳碱峰计算不低于3 000，色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2.2 溶液制备

精密称取氢溴酸樟柳碱对照品、氢溴酸东莨菪碱对照品和硫酸阿托品对照品各适量，加水溶解并稀释成约20 μg/mL的溶液作为系统适用性试验溶液。精密称取氢溴酸樟柳碱对照品10 mg，置100 mL容量瓶中，加水适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1 mL，置50 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得每1 mL中含氢溴酸樟柳碱2 μg的对照品溶液。取样品10片，剪碎，精密称取2片量(约含氢溴酸樟柳碱20 μg)，置10 mL容量瓶中，加水少量，充分振摇使膜完全润湿并溶解，再加水稀释至刻度，摇匀，用滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察:精密称取氢溴酸樟柳碱对照品0.015 98 g，置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀;精密吸取上述溶液 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，置 100 mL 容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。分别精密量取上述对照品溶液各100 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积(A)为纵坐标、对照品溶液质量浓度(C)为横坐标进行线性回归，回归方程为 A=101.21 C+2.834 1，r=1.000(n=6)。结果表明，氢溴酸樟柳碱的质量浓度在0.799～7.990 μg/mL范围内与峰面积线性良好。

精密度试验:取线性范围项下质量浓度为1.598μg/mL的樟柳碱对照品溶液100 μL，按上述色谱条件连续进样6针。结果峰面积的 RSD=0.64%(n=6)，表明方法的精密度良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液，分别在 0，1，2，3，4，6，8 h时进样。结果峰面积的 RSD=2.26%(n=7)，表明供试品溶液在8 h内稳定。

重复性试验:取同一批样品(批号为110301)6份，依法测定。结果含量的 RSD=1.56%(n=6)，表明方法的重现性良好。

加样回收试验:分别精密称取氢溴酸樟柳碱对照品0.011 14，0.013 25，0.011 18 g，置 50 mL 容量瓶中，加水适量使其溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液;精密称取9份由成都第一制药有限公司提供的空白辅料1.6 g，置100 mL容量瓶中，加水适量，充分振摇使辅料完全溶解;再精密量取3份对照品贮备液各 4.0，5.0，6.0 mL，分别置上述空白辅料溶液中，加水稀释至刻度，摇匀，依法测定，计算回收率。结果见表1。

表1 氢溴酸樟柳碱加样回收试验结果(n=9)

2.4 样品含量测定结果

取3批样品各2片，剪碎，置10 mL容量瓶中，加水充分振摇使膜完全溶解，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。另取干燥至恒重的氢溴酸樟柳碱对照品，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1 mL中含2 μg的溶液。按照拟订的色谱条件进行含量测定，结果3批样品中氢溴酸樟柳碱含量分别为219.83% ，233.04%和 201.27% 。

3 讨论

3批样品的含量测定值较大。通过试验发现，按现行标准中的配方比所制得的样品，其氢溴酸樟柳碱定性鉴别反应不明显，为了适应现行标准，只能增加样品中氢溴酸樟柳碱的含量。

通过不同流动相的选择[1－3]，氢溴酸樟柳碱、氢溴酸东莨菪碱和硫酸阿托品3种组分可以达到完全分离，而且硫酸阿托品的两种异构体也可以达到基线分离，说明此方法对托烷类生物碱样品的分离效果较好。通过方法学试验表明，建立的此方法可以对三维氢溴酸樟柳碱膜中的氢溴酸樟柳碱进行定量检测。

[1]王 彦.高效液相色谱法测定氢溴酸樟柳碱含量[J].药物分析杂志，1999，14(4):254－256.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:559－560.

[3]Chen Y，Chen HX，Du P，et al.Analysis of anisodine and identification of twenty of its metabolites in rat urine by liquid chromatography－tandem mass spectrometry[J].Chromatographia，2005，62(11):563 － 569.