肾素(前体)受体在ox-LDL激活人脐静脉内皮细胞ERK1/2通路的作用

2013-09-14 09:25胡欣妍
中西医结合心脑血管病杂志 2013年10期
关键词:沙坦奥美肾素

胡欣妍

动脉粥样硬化类疾病是严重威胁人类健康的疾病,目前一 致认为,动脉粥样硬化的病理本质是动脉内膜的慢性炎症。动脉粥样硬化在各种危险因素如病毒、机械损伤、糖尿病等引起内皮细胞损伤或者功能失调,血管内膜产生一种过度的慢性炎性增生反应[1]。血脂异常,尤其氧化修饰低密度脂蛋白(ox-LDL)是最重要的致动脉粥样硬化危险因素。丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)是细胞内一条重要的信号转导通路,MAPK包括细胞外信号调节的蛋白激酶(ERK)、c-jun N 端激酶(JNK)/应激激活的蛋白激酶(SAPK)和P38。它们参与多种胞外启动信号的细胞内转导过程,具有调节细胞的生长、分化、凋亡的作用。肾素(前体)受体[(P)RR]是Nguyen等在2 0 0 2年克隆出的,(P)RR表达在各种细胞中,如神经细胞、肾小球系膜、单核细胞、心肌和平滑肌细胞[2-7],由350个氨基酸组成,含有1个非糖基化且高度疏水的氨基末端,该区域与肾素/肾素前体的结合有关,还含有1个由20个氨基酸构成的尾部。本研究旨在观察ox-LDL对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的ERK1/2信号通路的激活及(P)RR的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 健康产妇脐带由大连市妇产医院提供。氧化低密度脂蛋白购自Sigma公司;Renin Receptor siRNA购自Santa公司;兔抗 人 p-ERK1/2 抗 体,ERK1/2 抗 体,β-actin购 自 BIOWORLD公司;RNAiso、RT-PCR试剂盒及引物购自TaKaRa公司;羊抗兔辣根过氧化物酶标记IgG二抗购自Invitrogen公司;siRNA Transfection Reagent购自Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1 人脐静脉内皮细胞的培养 无菌采集健康新生儿脐带,长约20cm,用PBS将其冲洗干净,向脐静脉中注入0.1%Ⅱ型胶原酶,收集消化液离心弃上清,收集细胞。当细胞生长至融合状态时,加入胰蛋白酶溶液进行传代,将2代~6代细胞用于实验。

1.2.2 实验分组及检测指标 不同浓度ox-LDL(0mg/L、25 mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L)与 HUVECs共同作用15min。浓度为100mg/L的ox-LDL不同时间,即0min、15 min、3 0min、6 0min、1 2 0min,用 Western blot方 法 检 测p-ERK 1/2、ERK 1/2蛋 白 。RNA干 扰 对HUVECs表 达(P)RRmRNA的影响:空白组;RNA干扰组:siRNA分别转染HUVECs 2 4h、4 8h、7 2h;转染试剂组:转染试剂1处理HUVECs2 4h、4 8h、7 2h,用RT-PCR的方法检测(P)RR mRNA。(P)RR在ox-LDL激活 HUVECs表达ERK1/2通路的作用:空白组;奥美沙坦(10-5M)+PD123319(10-4M);奥美沙坦 (10-5M)+PD123319(10-4M)+ox-LDL 组;siRNA转染+奥美沙坦(10-5M)+PD123319(10-4M)组;siRNA转染+奥美沙坦(10-5M)+PD123319(10-4M)+ox-LDL组;转染试剂+奥美沙坦(10-5M)+PD123319(10-4M)+ox-LDL组。用 Western blot方法检测p-ERK1/2、ERK1/2蛋白。

1.2.3 RT-PCR方法 提取HUVECs的RNA,逆转录合成cDNA(P)RR上游 PCR引物序列:5′-ATTGGCCTATACCAGGAGAG-3′;(P)RR 下 游 PCR 引 物 序 列:5′-TTCCCCATAACGCTTC CCAA-3′。进行PCR扩增:取PCR产物用琼脂糖凝胶电泳,然后凝胶成像仪成象。

1.2.4 蛋白质印迹 提取各组HUVECs总蛋白,在SDS凝胶上电泳,转入硝酸纤维素膜,加入兔抗人p-ERK1/2、ERK1/2抗体,4℃孵育过夜。充分洗膜后加入羊抗兔辣根过氧化物酶标记IgG二抗,37℃3h,充分洗膜后,加入ECL反应体系,曝光显影。

2 结 果

2.1 不同浓度ox-LDL对HUVECs的ERK1/2通路磷酸化的影响 25mg/L~150mg/L的ox-LDL均能引起 HUVECsERK1/2信号通路的磷酸化增加,以浓度为100mg/L的ox-LDL作用最强。详见图1。

图1 不同浓度ox-LDL对HUVECs的ERK1/2通路磷酸化的影响

2.2 ox-LDL(100mg/L)不同时间对 HUVECs的 ERK1/2通路磷酸化的影响 ox-LDL引起HUVECs的ERK1/2通路磷酸化增加,从5min开始增加,15min达高峰,此后开始下降。详见图2。

图2 ox-LDL(100mg/L)不同时间对 HUVECs的ERK1/2通路磷酸化的影响

2.3 siRNA转染 HUVECs对 HUVECs表达(P)RRm RNA的影响 siRNA转染HUVECs,可明显减少HUVECs表达(P)RRm RNA,以72h作用最明显。详见图3。

图3 siRNA转染HUVECs对HUVECs表达(P)RRm RNA的影响

2.4 RNA干扰(P)RR对HUVECs的ERK1/2通路磷酸化的影响 在用奥美沙坦和PD123319阻断AT1和AT2受体的情况下,ox-LDL 引 起 HUVECs的 P-ERK1/2增 加,RNA 干 扰(P)RR表达后,可以明显抑制ox-LDL可引起HUVECs的P-ERK1/2增加,说明(P)RR可以不依赖于血管紧张素Ⅱ,参与激活HUVECs的ERK1/2通路。详见图4。

图4 RNA干扰(P)RR对HUVECs的ERK1/2通路磷酸化的影响

3 讨 论

在MAPK家族中,人们发现得最早、研究得最透彻的是ERK通路。多种刺激因素,如血栓素A2、血管紧张素Ⅱ、转化生长因子等都可激活ERK。通过磷酸化激活转录因子,将来自细胞外刺激信号传导至细胞核内,调节相应基因的表达,与细胞分化、细胞凋亡、组织入侵和转移有关。P(RR)是肾素、肾素前体的功能性受体,不但能够与肾素、肾素前体结合,还可介导生物学功能。肾素与(P)RR结合可使肾素的活性增加为游离肾素的4~5倍。肾素前体与(P)RR结合会引起肾素前体分子构象发生改变而被激活,同时增加了血管紧张素-Ⅰ的产生,并可直接激活细胞内信号转导通路,如MAP激酶的ERK1/2和P38信号转导通路、热休克蛋白27激酶、PI3K-P85[8]等通路,调节某些基因的表达,进而导致细胞纤维化、生长和重塑。

本实验用奥美沙坦和PD123319阻断血管紧张素Ⅱ的AT1和AT2受体,排除了ox-LDL、肾素、肾素前体通过使血管紧张素Ⅱ产生增加,进而作用于其受体而发挥作用。结果发现,siRNA(P)RR转染 HUVECs72h,可以明显抑制(P)RRmRNA 的表达。并且抑制了ox-LDL对HUVECs的ERK1/2信号通路的激活。这说明(P)RR参与了ox-LDL激活HUVECs的ERK1/2通路。推测ox-LDL在增加HUVECs表达肾素、肾素前体,进而肾素、肾素前体作用于(P)RR激活 HUVECs的ERK1/2通路。抑制(P)RR的表达,可以有效抑制内皮细胞的ERK1/2同路的激活,这为抑制ox-LDL引起的内皮细胞的ERK1/2通路的激活,提供了一个新的治疗方法。

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