全蝎纯化液对凝血酶诱导血管内皮细胞释放NO、TFPI及表达TF的影响1）

吴 萍，谭 茜，罗亚君，何义化，陈 博，殷红艳，许光明

血管内皮细胞（vascular endothelial cell，VEC）是一种具有广泛生物活性的细胞，能分泌作用不同的活性物质，以维持血管收缩和舒张、抗凝与促凝平衡[1]。当VEC功能受损时，其合成分泌功能失调，使血液呈高凝状态。因此与心脑血管系统中的血栓事件发生具有密切关系[2]。近几年国外研究表明，组织因子（tissue factor，TF）途径是生理止血的凝血过程和病理血栓形成的启动环节[3，4]，组织因子是外源性凝血酶途径的启动因子，在正常生理活性凝血反应及病理性血栓形成起重要作用[5]。内皮细胞正常情况下并不表达TF，但在某些病理状态及凝血酶作用下却大量表达，这些成为目前国外研究的热点，但在国内研究较少。组织因子途径抑制物（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）主要由内皮细胞分泌，具有抗凝、抗血栓等作用。NO是内皮细胞分泌的另一种生物活性物质，具有抑制血小板黏附、聚集及拮抗内皮素，调节TF表达，起抗血栓形成的作用。全蝎（Bathus martesckarsch）临床多用于治疗急性惊风、中风面瘫、头痛、破伤风痉挛等症，这类疾病常与体内血小板活化、凝血酶形成等高凝状态，乃至血栓形成有密切关系，抗凝、抗血小板成为治疗这类疾病的重要手段[6]。因此抗血栓形成和消除高凝状态，是治疗此类疾病的重要手段之一。已有研究表明，全蝎具有抗凝和抗血栓形成及抑制血小板聚集的作用。为进一步揭示其作用机制，本研究以凝血酶－血管内皮细胞反应为对象，研究全蝎纯化液对凝血酶诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC）抗凝功能改变的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人脐静脉内皮细胞由武汉大学典型物种保存中心提供。新生小牛血清（杭州四季青生物制品研究所产品）。RPMI－1640培养基、胰蛋白酶为美国Gibco公司产品，磷酸缓冲盐（PBS）干粉为武汉博士德公司产品。CO2培养箱为美国谢尔登制造公司产品，酶标仪为芬兰Labsystens集团产品。凝血酶为中国医学科学院血液学研究所产品。TF、TFPI试剂盒购自美国Assaypro公司，NO试剂盒购自南京建成生物工程研究所。全蝎购自湖南省医药公司，经水煮醇沉、凝胶过滤、离子交换层析等分离纯化过程将其真空冷冻干燥成粉末，－20℃保存备用，使用前用含10%小牛血清的RPMI1640培养液配成所需浓度工作液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌。

1.2 HUVEC培养与鉴定 将内皮细胞加入RPMI－1640培养液（含10%小牛血清、100kU／L链霉素、100kU／L青霉素）中，5%、37℃二氧化碳培养箱中培养。倒置显微镜下观察内皮细胞呈多角形、铺石样镶嵌排列，待细胞长满培养瓶底后用0.25%胰蛋白酶消化传代，经Ⅷ因子（FⅧ）免疫荧光鉴定并选择生长良好的HUVECs用于实验。

1.3 实验分组及药物处理 选取生长良好的2代～3代细胞。将融合生长的HUVECs用0.25%胰蛋白酶消化吹打制成单细胞悬液，根据预实验结果调节细胞密度为7.5×104个／mL，接种于96孔培养板中，每孔200μL。37℃、5%CO2条件下培养。培养的内皮细胞融合后，随机分为空白对照组，凝血酶（10U／mL）刺激组，全蝎纯化液高、中、低剂量组。全蝎纯化液高、中、低剂量组加入10U／mL的凝血酶后分别加入24μg／mL、12 μg／mL、6μg／mL全蝎纯化液。空白对照组加入等量培养液，每组设10个复孔，置37℃5%CO2培养箱中培养12h进行检测。

1.4 检测指标 取细胞培养上清液测定TFPI活性，细胞冻融液测TF活性，均采用发色底物法。NO含量测定采用硝酸还原酶法，严格按试剂盒操作说明书操作步骤进行。

2 结 果

2.1 全蝎纯化液对凝血酶诱导HUVECs表达TF和释放TFPI的影响 全蝎纯化液各剂量组能抑制基础条件下HUVECs表达TF，凝血酶能明显促进HUVECs表达TF，与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.01），而全蝎纯化液能显著抑制其作用（P＜0.01）。HUVECs在基础条件下能释放一定量的活性物TFPI，凝血酶能明显抑制HUVECs释放TFPI，与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.01），而全蝎纯化液能拮抗其作用（P＜0.05）。详见表1。

表1 全蝎对凝血酶诱导HUVECs表达TF和释放TFPI、NO的影响（±s）

表1 全蝎对凝血酶诱导HUVECs表达TF和释放TFPI、NO的影响（±s）

组别 TF活性（%） TFPI活性（%） NO（μmol／L）空白对照组 6.12±1.95 2.05±0.81 7.00±1.32凝血酶组 13.98±1.122） 0.63±0.322） 10.76±1.961）全蝎高剂量组 4.89±0.984） 1.62±0.983） 27.32±3.124）全蝎中剂量组 5.22±0.864） 1.21±0.673） 20.48±2.444）全蝎小剂量组 6.43±1.014） 0.99±0.213） 17.44±2.204）与空白对照组比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01；与凝血酶组比较，3）P＜0.05，4）P＜0.01

2.2 全蝎纯化液对凝血酶诱导HUVECs释放NO的影响HUVECs在基础条件下能释放定量的NO，凝血酶促进HUVECs释放NO，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；全蝎纯化液能显著地促进HUVECs释放NO，与对照组和凝血酶组相比，差异有统计学意义（P＜0.01），但凝血酶和全蝎纯化液两者之间无协同作用。详见表1。

3 讨 论

近年来的大量研究表明，与内在凝血途径相比，组织因子途径（外源性途径），在生理性止血过程和病理过程中的血栓形成具有更为重要的意义。TF是一种跨膜糖蛋白，在机体凝血过程中起至关重要的作用，是内、外凝血系统的始动因子，也是血栓形成的关键因素。VEC表达的TF是炎症反应和血栓形成的主要衔接物，研究抑制促VEC诱生性表达的TF物质，已成为防治血栓性疾病的重要策略之一[7]。现已证实，凝血酶能明显增加HUVECs表达TF，已知TF增加又使凝血酶生成增加，二者具有互相加强效应，这种正反馈作用导致血液促凝活性增加，血小板易黏附、聚集，血栓形成。TF、凝血酶增多，有利于平滑肌细胞迁移、增生，加重内皮细胞损害。本实验结果显示，凝血酶能刺激HUVEC大量表达TF，而全蝎能明显抑制凝血酶所诱导的TF表达，从而起保护血管内皮细胞和抗血栓形成的作用。

TFPI是近几年发现的一种新型的抗凝物质，是组织因子在体内特异性的生理抑制剂，可以调节TF的活性[8]。它首先和FⅩa结合，然后在Ca2＋存在条件下，再与TF／FⅦa结合形成四聚体，从而抑制FⅩa和TF／FⅦa活性，起抗凝作用[9]。本研究表明，凝血酶能显著增加HUVEC表达TF，而全蝎纯化液能抑制这种作用。凝血酶能明显抑制HUVEC的TFPI活性使TFPI活性降低。使血液呈高凝状态，这与国外的研究报告相一致。结果显示全蝎纯化液可提高凝血酶诱导EVC培养液中的TFPI活性，表明其对凝血酶的抑制作用。

NO是内皮细胞分泌的另一种生物活性物质，它可以使血管平滑肌舒张，血压降低，抑制血小板黏附、聚集及平滑肌细胞增生、迁移，拮抗内皮素、调节TF表达，起抗血栓形成和抗动脉粥样硬化的作用，以外还可以清除氧自由基等。若内皮受损，NO分泌减少，易导致血管痉挛，成为动脉粥样硬化发生机制之一。本实验结果显示，全蝎纯化液能促进内皮细胞释放NO，这可能与它的凝血化瘀、抗凝、抗血栓形成机制和对心脑血管疾病具有治疗作用有关。

以上研究结果显示全蝎纯化液可促进HUVECs合成NO，可拮抗凝血酶抑制TFPI释放，抑制凝血酶诱导的TF表达，可为临床合理应用全蝎提供新的理论和实验依据。

[1]易小民，谭茜，彭延古，等.全蝎纯化液对凝血酶诱导血管内皮细胞释放血管性血友病因子和6－酮－前列腺素F1a的影响[J].中国中西医结合急救杂志，2010，17（6）：334－336.

[2]贺石林.组织因子途径及其临床意义[J].中国实用内科杂志，1997，17（19）：556－558.

[3]Camerer E，Kolst AB，Prydz H.Cell biology of tissue factor，the principle initaltor of blood coagulation[J].Thromb Res，1996，81（1）：1－41.

[4]Sterud B.A global view on the role of monocftes and plates in atherogeneais[J].Thromb Res，1997，85（1）：1－22.

[5]Nemerson Y.The tissue factor pathway of blood coagulation[J].Semin Hematol，1992，29（3）：170－176.

[6]彭延古，黄莺，易小民，徐爱良.全蝎纯化液对凝血酶所致血液凝固的影响[J].中国中西医结合急救杂志，2010，17（3）：138－140.

[7]McVey JH.Tissue factor pathway[J].Baillieres Best Pract Res Clin Haematol，1999，12（3）：361－372.

[8]成春英，孙勇，文志斌，等.川芎嗪对凝血酶诱导血管内皮细胞组织因子表达的影响[J].南方医科大学学报，2009，29（8）：1743－1747.

[9]Lwaleed BA，Bass PS.Tissue factor pathway inhibitor：Structure，biology and involvement in disease[J].J Pathol，2006，208（3）：327－339.